Studenti se seznámí se základními biochemickými metodami. Metodou, která má široké uplatnění v biochemii, je gelová chromatografie, studenti separují protein ze směsi nebo stanoví relativní molekulovou hmotnost neznámého proteinu. Separace proteinů a stanovení relativní molekulové hmotnosti se provádí rovněž elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS. Velká pozornost je věnována zásadám práce s enzymy: stanovení specifické aktivity enzymu, zjištění afinity enzymu k substrátu, stanovení maximální rychlosti reakce, pH optima, sledování časového průběhu reakce a vliv inhibitorů a aktivátorů na enzymovou reakci. Přítomnost izoenzymů je demonstrována na příkladu laktátdehydrogenasy, kterou studenti separují v polyakrylamidovém gelu za nativních podmínek a detekují enzymovou aktivitu v gelu.
Poslední úprava: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (17.12.2024)
Students will become familiar with basic biochemical methods. A method that has wide application in biochemistry is gel chromatography, students separate a protein from a mixture or determine the relative molecular mass of an unknown protein. Separation of proteins and determination of relative molecular mass is also performed by electrophoresis in polyacrylamide gel in the presence of SDS. Great attention is paid to the principles of working with enzymes: determination of specific enzyme activity, determination of enzyme affinity for the substrate, determination of maximum reaction rate, pH optimum, monitoring of the reaction time course and the influence of inhibitors and activators on the enzyme reaction. The presence of isoenzymes is demonstrated on the example of lactate dehydrogenase, which students separate in a polyacrylamide gel under native conditions and detect enzyme activity in the gel.
Odeslat zpětnou vazbu
Dostupné výsledky překladu
Poslední úprava: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (17.12.2024)
Literatura
Laboratorní cvičení z biochemie, editoři: M. Kodíček, O. Valentová; Praha 2000
Poslední úprava: Kotek Jan, prof. RNDr., Ph.D. (20.03.2018)
Požadavky ke zkoušce
- práce na úloze bude umožněna jen studentům, kteří prokážou dostatečné porozumění principům - před odchodem je nutné nahlásit získané výsledky - protokol ve formátu pdf (případně vytištěný) odevzdat nejpozdeji do týdne, jinak úloha propadá - v případě oprav musí být protokol bez vad schválen do tří týdnů od vypracování úlohy - k zápočtovému testu může scházet nejvýše jeden protokol - pro získání zápočtu je třeba absolvovat prezentaci vybrané úlohy splnit podmínky závěrečného testu odevzdat protokoly ke všem úlohám vrátit klíč od skříňky na chodbě
Poslední úprava: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (11.01.2023)
Sylabus -
Studenti vypracují vždy jednu úlohu z následujících okruhů úloh: 1. Izolace proteinu s enzymovou aktivitou a stanovení specifické aktivity. 2. Gelová chromatografie. 3. Separace proteinů elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v prostředí SDS a stanovení relativní molekulové hmotnosti těchto proteinů. 4. Sledování afinity enzymu k substrátu - určení Michaelisovy konstanty a maximální rychlosti reakce. (5. Určení pH optima, sledování vlivu inhibitorů a aktivátorů na aktivitu enzymu, časový průběh enzymové reakce, detekce enzymové aktivity v polyakrylamidovém gelu.) (6. Práce s DNA: Hledání pachatele trestného činu.) 7. Ústní prezentace teorie a výsledků jedné úlohy.
Pro úspěšnou práci v praktiku je nezbytné ovládat software používaný k vyhodnocování výsledků (tabulkový procesor - výpočty se vzorci, sestavení správného typu grafu, chybové úsečky; grafický program - ořez a projasnění fotografií; matematický program - provedení nelineární regrese). K dispozici jsou vzorové protokoly, které slouží jednak jako vzor odevzdávaných výsledků a jednak si podle nich studenti mohou předem vyzkoušet vyhodnocování dat.
Poslední úprava: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (28.09.2021)
1. Isolation of a protein - enzyme, determination of specific activity
2. Gel chromatography of proteins (separation, relative molecular mass determination)
3. SDS - polyacrylamide electrophoresis (determination of relative molecular mass of proteins)
4. Practical enzymology - kinetic characteristics, Michaelis constants, maximal reaction rate, pH optimum, activation and inhibition of enzymes, electrophoretic separation of isoenzymes and detection of the enzyme activity in gel
5. DNA manipulation (restriction analysis)
6. Oral presentation of one experiment
Poslední úprava: Rubešová Jana, RNDr., Ph.D. (26.02.2018)
Výsledky učení -
Student aplikuje jednu z technik izolace proteinu, stanoví enzymovou aktivitu, změří koncentraci proteinu a vypočítá specifickou aktivitu.
Student sleduje afinitu enzymu k substrátu a stanoví Michaelisovu konstantu a maximální rychlost reakce.
Student stanoví teplotní a pH optimum vybraného enzymu, sleduje vliv inhibitoru na aktivitu enzymu, z aktivitu a jednotlivé izoformy vybraného enzymu po elektroforetické separaci za nativních podmínek.
Student používá gelovou chromatografii pro separaci proteinů, sestaví kalibrační závislost molekulové hmotnosti na elučním objemu, zjistí molekulovou hmotnost neznámého proteinu, určí distribuční koeficient vybraného proteinu.
Student provede elektroforetickou separaci proteinů v polyakrylamidovém gelu v prostředí SDS a určí jejich relativní molekulovou hmotnost.
Student změří koncentraci DNA, provede elektroforetickou separaci DNA po štěpení restrikční endonukleasou, a porovná vzorky DNA podezřelých s místem činu.
Poslední úprava: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (17.12.2024)
The student will apply one of the protein isolation techniques, determine enzyme activity, measure protein concentration, and calculate specific activity. The student observes the affinity of the enzyme for the substrate and determines Michaelis constant and maximum reaction rate. The student determines the temperature and pH optimum of a selected enzyme, observes the effect of an inhibitor on enzyme activity, and observes the activity and individual isoforms of a selected enzyme after electrophoretic separation under native conditions. The student uses gel chromatography to separate proteins, develops a calibration dependence of molecular weight on elution volume, determines the molecular weight of an unknown protein, and determines the distribution coefficient of a selected protein. The student will perform electrophoretic separation of proteins in a polyacrylamide gel under SDS conditions and determine their relative molecular weight. The student will measure DNA concentration, perform electrophoretic separation of DNA after restriction endonuclease cleavage, and compare suspect DNA samples to the crime scene.
Poslední úprava: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (17.12.2024)
