PředmětyPředměty(verze: 809)
Předmět, akademický rok 2017/2018
   Přihlásit přes CAS
Praktikum z vývojové biologie - MB150C07
Anglický název: Developmental Biology - a practical course
Zajišťuje: Katedra buněčné biologie (31-151)
Fakulta: Přírodovědecká fakulta
Platnost: od 2016
Semestr: letní
E-Kredity: 2
Způsob provedení zkoušky: letní s.:
Rozsah, examinace: letní s.:0/3 Z [dny/semestr]
Počet míst: 210
Minimální obsazenost: neomezen
Stav předmětu: vyučován
Jazyk výuky: čeština
Garant: doc. RNDr. Ing. Vladimír Krylov, Ph.D.
Vyučující: doc. RNDr. Ing. Vladimír Krylov, Ph.D.
RNDr. Lenka Libusová, Ph.D.
Mgr. Marie Macůrková, Ph.D.
Mgr. Aleš Petelák
RNDr. Nataša Šebková, Ph.D.
Atributy: Modul Fyziologie a anatomie / morfologie
Korekvizity : MB150P11
Neslučitelnost : MB150C07E
Záměnnost : MB150C07E
Je neslučitelnost pro: MB150C07E
Je záměnnost pro: MB150C07E
Anotace -
Poslední úprava: doc. RNDr. Ing. Vladimír Krylov, Ph.D. (28.02.2013)

Praktická cvičení jsou zaměřena na prohloubení znalostí získaných na přednáškovém kurzu z vývojové biologie. Hlavní důraz je kladen na pohlavní rozmnožování a embryonální vývoj u vybraných modelových organismů. Praktická cvičení jsou 3 denní. Během této doby mají studenti možnost pracovat s mikroskopickými trvalými preparáty. Prakticky si dále vyzkouší mikromanipulační techniky při izolaci prasečích oocytů z vaječníků. Část izolovaných oocytů je fixována po 24 hodinách maturace (stádium metafáze I) a část je kultivována dalších 20 hodin v maturačním médiu do stádia metafáze II. Po té následuje oplození kančími spermiemi (in vitro fertilizace - IVF) a pozorování kontaktu obou gamet. V rámci studia embryonálního vývoje mají studenti možnost stanovit expresní domény vybraných Hox genů na modelu C. elegens.
Literatura
Poslední úprava: doc. RNDr. Ing. Vladimír Krylov, Ph.D. (22.04.2015)

Gilbert S.F: Developmental Biology. 10 vyd. a dřívější, Sunderland (MA): Sinauer Associates, části kapitol z 10. vyd. jsou dostupné na internetu: http://10e.devbio.com/contents.php?sub=1&art=1&full=1

Wolpert, L.: Principles of Development (2. vydání), Oxford University Press, 2002.

Krylov V. Determinace nebo regulace aneb Jak vytvořit tělo, Vesmír, 2015/2, ročník 94(145), str. 110-113.

Krylov V. Posviťte si na biologii, kapitola " Jak se staví tělo" , Nakladatelství P3K, 2014, str. 9-21 - Monografie není v prodeji. Pdf formát monografie je k dispozici na Moodle (dl2.cuni.cz) - předmět Vývojová biologie, sekce: Studijní materiál. Heslo pro vstup do kurzu: morphogen

Sládeček F.: Rozmnožování a vývoj živočichů, Academia Praha 1986

Požadavky ke zkoušce
Poslední úprava: doc. RNDr. Ing. Vladimír Krylov, Ph.D. (09.11.2011)

Forma zkoušky - zápočet spojený s kontrolou a hodnocením protokolů vypracovaných v rámci praktického cvičení

Sylabus -
Poslední úprava: doc. RNDr. Ing. Vladimír Krylov, Ph.D. (02.03.2016)

I. ČÁST - TRVALÉ PREPARÁTY

Vývojová stadia žáby Drápatky vodní - Xenopus laevis

Cíl: nakreslit, popsat a určit jednotlivá vývojová stadia Xenopus laevis

Předložená stadia:

1. oocyty
2. stadium 2 buněk
3. stadium 4 buněk
4. stadium 8 buněk
5. stadium 32 buněk
6. blastula
7. časná gastrula
8. střední a pozdní gastrula
9. neurula
10. stadium ocasního pupene 1
11. stadium ocasního pupene 2
12. pulec 1
13. pulec 2
14. pulec 3


Řezové preparáty

varle - Xenopus laevis
fragment ovaria - Xenopus laevis
varle - myš
ovarium - myš
oplozené oocyty Xenopus laevis - pronukleus (pigmentová stopa spermie)
oplozené oocyty Xenopus laevis - samčí a samičí pronukleus - fúze pronukleí (pigmentová stopa spermie)

spermie:

myš
čolek
dešťovka
kohout
drápatka

II. ČÁST - ZRÁNÍ PRASEČÍCH OOCYTŮ A IN VITRO FERTILIZACE

Zrání prasečích oocytů a in vitro fertilizace

Obecný úvod

Oogeneze u savců

Samičí pohlavní buňky u savců procházejí 3 důležitými stádii:

1.     Dělení - mitotický vznik oogonií (počet založen před narozením)

2.     Růst - syntéza proteinů, různých mRNA a dalších důležitých komponent pro časný embryonální vývoj. Společně s rostoucím oocytem dochází ke vzniku folikulu, který svou tekutinou brání zrání oocytu. Oocyt je většinou zastaven v prometafázi I meiotického dělení. (1. meiotický blok). Jádro se nazývá zárodečný váček (GV - Germinal Vesicle).

3.     Zrání - po ovulaci se oocyt uvolní z folikulu, čímž dojde k tzv. znovuzahájení meiozy.  To se projeví rozpadem zárodečného váčku (GVBD-Germinal Vesicle Break Down) a posléze  uspořádáním chromozómů do metafáze I. Po krátké anafázi I - telofázi I oocyt vyčkává na oplození většinou v metafázi II, kdy je možné pozorovat vyloučené 1. pólové tělísko. Přechody mezi jednotlivými fázemi jsou hlavně řízeny CDK1 (Cdc2) a cyklinem B, které dohromady tvoří MPF (Maturation Promoting Factor). Hladina jeho aktivní formy je nejvyšší v metafázi I a hlavně v metafázi II. V období anafáze I - telofáze I je naopak hladina této formy nejnižší. U savců je oocyt až do oplození většinou zastaven v metafázi II (2. meiotický blok). Po uvolnění z prostředí folikulu dochází GVBD do 6-ti hodin. Metafáze I je pozorovatelná mezi 20 - 24 hodinou. Metafáze II pak mezi 42-48 hodinou od izolace.

Oplození u savců

Spermie v pohlavním traktu samice u savců procházejí procesem kapacitace. Po té jsou schopné oplození. Ke kontaktu spermie a oocytu dochází zhruba v horní třetině vejcovodu. Spermie překoná vrstvy kumulárních buněk a po kontaktu se zónou pellucidou dochází k akrozomální reakci (vylití proteolytických enzymů). Po průniku spermie do oocytu nedochází u savčích oocytů ke klasickému rychlému bloku polyspermie (změna polarity oocytární membrány), který známe od ježovky. Ten nemusí být tolik potřebný vzhledem k relativně malému počtu spermií, které se k oocytu dostanou. Dochází však k vylití tzv. kortikálních granulí z oocytu (ekvivalent pomalého bloku polyspermie) a dlouhodobému zabránění vazby a průniku dalších spermií přes zonu pellucidu. Tento proces proběhne mezi 30-60 minutami po oplození a během této doby dojde i ke změnám na plasmatické membráně, které znemožní průnik spermií do cytoplasmy. Průnikem spermie do oocytu dojde pak k jeho aktivaci oscilacemi Ca2+ iontů a k dokončení meiozi. Vzniká tak postupně samičí prvojádro. Současně hlavička spermie začíná dekondenzovat do podoby samčího prvojádra. U obou prvojader po té dochází k syntéze DNA. U savců, na rozdíl např. od ježovky, nedochází v tomto okamžiku k jejich fúzi ale k oddělené kondenzaci do chromozómů v rámci profáze. Po té jsou samčí a samičí chromozómy promíchány v ekvatoriální rovině a během anafáze a telofáze vznikají dvě pravá somatická jádra.

Praktická část

Úkol pro 1. den

Izolace prasečích oocytů z folikulů aspirační metodou.

Folikuly vaječníku nabodneme injekční stříkačkou s jehlou a odsáváme folikulární tekutinu, která obsahuje volné oocyty obalené vrstvami kumulárních buněk. Po té aspirovanou tekutinu přeneseme do víčka 3 cm Petriho misky.

Pod stereobinolupou skleněnou kapilárou nasáváme jednotlivé oocyty, které přenášíme do druhé 3 cm Petriho misky s 4 kapkami (4 x 50 µl) manipulačního média (M2) pod olejem. Izolované oocyty prohlížíme pod stereobinolupou. Prasečí oocyty jsou tmavé (lipidová granula) a jsou obaleny několika vrstvami kumulárních buněk. Oocyty spočítáme a rozdělíme do dvou skupin. 1. skupina bude tvořena méně kvalitními oocyty a je určena pro fixaci po 24 hodinách kultivace (stádium metafáze I). Ve 2. skupině by měly být vysoce kvalitní oocyty (rovnoměrná cytoplasma a 3-5 vrstev kumulárních buněk. Ty necháme kultivovat 42-48 hodin do stádia metafáze II s následným in vitro oplozením kančími spermiemi.

1. skupinu oocytů přeneseme skleněnou kapilárou do 4-jamkové destičky s 500 ml média  M199 se 4 mg/ml GPBoS (růstové proteiny bovinního séra) překrytého 500 µl parafinového oleje. Druhou skupinu obdobně přeneseme do druhé 4-jamkové destičky se stejným médiem. Po té obě destičky kultivujeme v termostatu při teplotě 38,5 °C a 5% CO2).

Úkol pro 2. den

Fixace 1. skupiny oocytů po 24 hodinové maturaci

Z termostatu vyjmeme 4 jamkovou destičku s oocyty určenými pro fixaci (1. skupina oocytů). Do každé z jamek napipetujeme á 25 ml 0,1% hyázy (Hyaluridonáza) a zamícháme. Tento enzym rozvolní expandovaný kumulus a umožní odstranění jeho buněk. Asi po 3-5 minutách oocyty přeneseme do kapky manipulačního média (M2) v 3 cm Petriho misce a odstraníme zbylé kumulární buňky protahováním tenkou skleněnou kapilárou. Po očištění si všímáme poměrně silné zóny pellucidy, která je dobře patrná při polovičním zástinu. Oocyty poté fixujeme následujícím způsobem.

Osušíme podložní sklo, které jsme vyjmuli z etanolové lázně. Podle velikosti krycího skla naneseme do budoucích rohů trochu vazelíny z připravené injekční stříkačky. Skleněnou kapilárou přeneseme očištěné oocyty do středu pole vymezeného vazelínou. Opatrně přiložíme očištěné krycí sklo a pinzetou jemně tlačíme na jeho rohy (v místech, kde se nachází vazelína). POZOR NA PŘÍLIŠNÝ TLAK - OOCYTY SNADNO PRASKAJÍ. Hotový preparát vložíme do kyvety s 12 ml fixáže (etanol:octová kyselina, 3:1).

Úkoly pro 3. den

1.   In vitro fertilizace

Spermie určené pro in vitro fertilizaci označíme vitálním barvením jádra a mitochondrií (Hoechst 33258 + Mitotracker Red CMX Ros) následujícím způsobem.

Odpipetujeme 3 ml spermií do 10 ml zkumavky s modrým uzávěrem. Zkumavku centrifugujeme při 700G (2.650 ot/min - centrifuga MPW-340) po dobu 5 minut. Pasteurovou pipetou odebereme supernatant a přidáme 7 ml sterilního PBS + 0,01% PVA (polyvinylalkohol) z lahvičky. Vše důkladně zamícháme a centrifugujeme 5 minut při 700 G. Tento krok opakujeme ještě jednou. Na závěr odsajeme supernatant a spermie resuspendujeme ve 2 ml PBS + 0,01% PVA. K suspenzi přidáme 5 µl Mitotrackeru (1 mM roztok v DMSO) a 2 µl Hoechst 33258 (1 mg/ml). Vše důkladně zamícháme. Do 1,5 ml Eppendorfky napipetujeme 990 µl destilované vody. Ze suspenze odebereme 10 µl které přidáme do zkumavky s vodou a vše důkladně promícháme (spermie jsou nyní 100 x ředěné a jsou znehybněné). Takto vzniklá suspenze je určená pro počítání spermií. Zbytek původní suspenze necháme inkubovat 30-45 minut při 17°C.

Zjištění počtu spermií na ml provedeme následujícím způsobem. Ze suspenze (100 x ředěné) odebereme 10 µl a aplikujeme je mezi krycí a podložní sklo Burkerovy komůrky. Komůrku umístíme do mikroskopu a spočítáme spermie, které se nacházejí v 16 velkých čtvercových polích (oblast je ohraničena trojitou rýhou). Nepočítáme ty spermie, které leží mezi velkými čtverci. Postup opakujeme ještě 3 x na jiných místech Burkerovy komůrky. Výsledné čtyři hodnoty zprůměrujeme. Koncentraci spermií na ml vypočteme podle následujícího vzorečku:

 

X = průměrný počet spermií v 16 velkých čtvercových polích x 15 625 x 100

 

Vysvětlení výpočtu:

 

Plocha jednoho velkého čtverce = 0,04 mm2 , hloubka komůrky = 0,1 mm

 

Objem tekutiny nad jedním velkým čtvercem =  0,04 x 0,1 = 0,004 mm3 (µl)

 

Objem tekutiny nad 16 velkými čtverci = 0,004 x 16 = 0,064 mm3 (µl)

 

Přepočet na 1 cm3 (ml) = 1000 / 0,064 = 15 625 (koeficient ve vzorečku)

 

Suspenzi jsme 100 x ředili. Proto je nutné výslednou hodnotu vynásobit.

 

Zatímco část skupiny počítá spermie, zbylí členové očistí oocyty maturované 42-48 hodin od kumulárních buněk stejným způsobem jako v případě oocytů určených pro fixaci po 24 hodinách zrání. Očištěné oocyty pozorujeme pod stereobinolupou a pokoušíme se nalézt 1. pólové tělísko, které se nachází pod zónou pellucidou jako kulovitý útvar. Přítomnost pólového tělíska značí, že oocyt je maturovaný a zastavený v metafázi II.

Mezitím máme připravené vitálně značené spermie. Každá skupina bude mít k dispozici jednu jamku s 500 µl média mTBM se 2 mg BSA/ml (IVF médium). Ze suspenze značených spermií odebereme tolik µl aby po naředění do 500 µl mTBM média byla výsledná koncentrace 500.000 spermií/ml. Vše opatrně zamícháme a do jamky se spermiemi přidáme očištěné oocyty. Vše necháme inkubovat 1-2 hodiny v termostatu při teplotě 38,5 °C, 5% CO2. Po té pozorujeme kontakt obou gamet pod stereobinolupou a následně pod fluorescenčním mikroskopem. Hlavičky spermií jsou obarveny modře, krček a část mid-piece je značen červeně.

2.   Barvení preparátů fixovaných oocytů po 24 hodinách maturace

Preparáty vyjmeme z kyvety s fixáží a osušíme spodní část podložního skla. 1 ml Pasteurovou pipetou naneseme malé množství acetoorceinu na horní hranu krycího skla. U spodní hrany odsáváme protékající tekutinu papírovou utěrkou. Pozorujeme jak se acetoorcein dostává od horní ke spodní hraně. Asi po 5 minutách naneseme na horní hranu krycího skla acetoglycerol a postupujeme stejně jako u acetoorceinu. Obarvení oocytů kontrolujeme pod stereobinolupou. Na závěr olemujeme krycí sklo lakem na nehty, který brání vysušování preparátu. Preparáty pozorujeme pod mikroskopem s fázovým kontrastem. Oocyt je zbarven do růžova. Chromozómy tvořící metafázi I jsou zbarveny karmínově červeně. Provedeme zákres preparátu.



III. ČÁST - EMBRYONÁLNÍ VÝVOJ C. ELEGANS

Háďátko Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans patří mezi volně žijící nepatogenní hlístice. V přírodě jej najdeme v půdě, kde se živí bakteriemi. U háďátka rozlišujeme dvě pohlaví - převažující hermafrodity se schopností samooplození (kombinace pohlavních chromozómů XX) a zřídka se vyskytující samce (0.05% populace, kombinace pohlavních chromozómů X0).
V laboratoři je C. elegans významným modelovým organizmem. Na jedné straně je to reprezentant mnohobuněčných eukaryot, na druhé straně má jednoduché průhledné tělo, které umožňuje studovat celou řadu procesů přímo v živém organizmu. Háďátko se také snadno pěstuje v laboratoři a má krátkou generační dobu (3-4 dny). Embryonální vývoj je determinační, s přesně daným počtem buněk, takže je možné sledovat vývoj každé jednotlivé somatické buňky. Dospělý hermafrodit má 959 somatických buněk, zatímco u dospělého samce jich je 1031.
Homeotické geny (Hox) kódují transkripční faktory, jejichž typickou součástí je evolučně konzervovaná DNA vazebná oblast nazývaná homeodoména. Hox geny hrají klíčovou úlohu v určení předozadní osy těla a v rozdělení těla na jednotlivé segmenty. U C. elegans došlo ke ztrátě některých Hox genů, navíc je zde exprese Hox genů více závislá na typu buněk než na konkrétní pozici v rámci těla. I přes tyto změny jsou Hox geny důležité pro určení osudu buněk.
Vaším úkolem je detegovat expresi tří různých Hox genů v C. elegans: mab-5 (ftz, fushi tarazu), lin-39 (Scr, sex combs reduced or Hox5) and egl-5 (Abd-B, abdominal B). Dostanete linie háďátek nesoucí lacZ reporter, jehož exprese je vždy řízena promotorem jednoho z výše zmíněných genů.

• Spláchněte háďátka z petriho misky 800μl pufru M9
• Centrifugujte 1000g/30 sec ~ 3000 rpm / 30 sec., opatrně odsajte supernatant
• Přidejte 800 μl dH2O, centrifugujte, opatrně odsajte supernatant
• Sušte ve speedvacu 20 min.
• Inkubujte ve 300 μl acetonu (na ledu) 2 min. 2x, vždy centrifugujte a odsajte supernatant
• Nechte zbylý aceton vytěkat
• Přidejte 250 μl barvicího roztoku, nechte vyvíjet, chraňte před světlem
• Reakci zastavte přidáním 800 μl pufru M9, centrifugujte a odsajte supernatant
• Zhotovte preparát a pozorujte pod mikroskopem


Barvicí roztok na 1ml
1M NaH2PO4 33 μl
0.5M Na2HPO4 332 μl
0.1M MgCl2 1 μl
0.3M K3Fe(CN)6 16.5 μl
0.3M K4Fe(CN)6 16.5 μl
1%SDS 4 μl
2% X-gal 12.5 μl
100% formamid 3 μl
voda 581.5 μl

Exprese Hox genů v embryu C. elegans:

(Wang et al., 1993)



DAPI barvení

DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) je fluorescenční barva vázající se na DNA, takže se využívá k barvení jednotlivých chromozómů i celých jader
Vám toto jednoduché barvení umožní lepší orientaci v morfologii různých vývojových stádií háďátka.

• Spláchněte háďátka z petriho misky 800μl pufru M9
• Centrifugujte 1000g/30 sec ~ 3000 rpm / 30 sec., opatrně odsajte supernatant
• Fixujte 300 μl metanolu (20 min., na ledu)
• Centrifugujte, opatrně odsajte supernatant
• Inkubujte ve 300 μl acetonu (10 min., na ledu)
• Centrifugujte, opatrně odsajte supernatant
• Promyjte 800 μl pufru M9, centrifugujte, opatrně odsajte supernatant
• Zvířata resuspendujte v roztoku DAPI (1 μg/ml), chraňte před světlem!!!
• Promyjte 800 μl pufru M9, centrifugujte, opatrně odsajte supernatant
• Zhotovte preparát a pozorujte pod fluorescenčním mikroskopem



 
Univerzita Karlova | Informační systém UK