Výuka kurzu Metody stanovení genové exprese se bude konat klasickou prezenční formou za dodržení všech platných nařízení v době konání praktického kurzu.
Kurz se skládá z teoretické a praktické části. Stěžejní část kurzu je věnována kvantitativnímu PCR a práci s RNA.
Nedílnou součástí cvičení je demonstrace použití nejčastějších metodických přístupů pro detekci a kvantifikaci
jednotlivých fází genové exprese za použití jednoho modelového genu. Kurz je určen nejen pro magisterské
studenty a doktorandy buněčné a molekulární biologie, ale je i vhodný pro další zájemce z široké škály dalších
biologických oborů, kteří ve své práci potřebují stanovit genovou expresi. Kurz probíhá jako turnusové třídenní praktikum.
Poslední úprava: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (09.10.2020)
The course is composed of the theoretical and the practical parts. Pivotal part of the course is dedicated to qPCR
and work with RNA. The most common experimental approaches for detection and quantification of gene
expression in its different phases will be demonstrated on one gene model.
The course is intended for cell and molecular biology MSc. and PhD. students, but it is also suitable for those
interested in gene expression determination methods from a wide variety of biological sciences. The course is organized as 3-day-turnus and is also accessible to english-speaking students.
Poslední úprava: Mašek Tomáš, RNDr., Ph.D. (22.08.2017)
Literatura -
K tomuto kurzu není doporučená literatura. Studenti obdrží protokoly s dalšími informacemi v průběhu praktických cvičení.
Poslední úprava: Mašek Tomáš, RNDr., Ph.D. (22.08.2017)
No original textbooks are available. All manuals, protocols and other directions will be provided during the course.
Poslední úprava: Mašek Tomáš, RNDr., Ph.D. (22.08.2017)
Požadavky ke zkoušce -
Studenti ukončí praktikum vypracováním protokolů a složením zápočtového testu. Více informací, texty, protokoly a presentace jsou pro studenty zapsané do kurzu k dispozici na http://web.natur.cuni.cz/~pospisek.
Poslední úprava: Mašek Tomáš, RNDr., Ph.D. (22.08.2017)
Students must pass examination test and provide correct working protocols. Other information including recommended literature, presentations and protocols are available on the webpage (http://web.natur.cuni.cz/~pospisek).
Poslední úprava: Mašek Tomáš, RNDr., Ph.D. (22.08.2017)
Sylabus -
V teoretické části tohoto kurzu budou vysvětleny nejen základní principy prováděných metod, ale i jejich výhody a limitace. Studenti též budou seznámeni se správným plánováním vhodného uspořádání experimentů, s vyhodnocováním dat a interpretací výsledků.
Praktická část bude demonstrována především na modelovém reportérovém genu pod kontrolou inducibilního promotoru.
Úlohy:
1/ Příprava pracoviště, laboratorního skla, plastiku a elektroforetických tanků pro práci s RNA. Vysvětlení principů práce s RNA. Izolace celkové RNA, stanovení její koncentrace, analýza pomocí denaturační agarózové elektroforézy, odstranění kontaminující DNA, syntéza cDNA.
2/ Srovnání klasického RT PCR s qPCR, relativní a absolutní kvantifikace transkriptu.
3) Stanovení počtu genových kopií – qPCR (vyhodnocení dat).
4/ Western blot
5/ Měření aktivity luciferázy, zhodnocení růstových vlastností buněk s různou mírou aktivity inducibilního promotoru.
Poslední úprava: Mašek Tomáš, RNDr., Ph.D. (22.08.2017)
Principles of the demonstrated methods, their advantages and limitations are explained in the theoretical part of the course. Experimental design, data evaluation and results interpretation will be also discussed.
In the practical part, we employ model gene reporter under the control of an inducible promoter.
Tasks:
1/ Principles of the work with RNA (preparation of solutions, disposables and other equipment). Total RNA isolation, concentration determination, RNA quality analysis using RNA denaturing agarose electrophoresis, DNaseI treatment, cDNA synthesis.
2/ RT PCR and qPCR approach comparison, absolute and relative quantification.
3/ Gene copy number determination by qPCR (data evaluation).
4/ Western blot
5/ Evaluation of inducible promoter activity by luciferase activity measurement and by cell growth determination.
Poslední úprava: Mašek Tomáš, RNDr., Ph.D. (22.08.2017)
Výsledky učení -
Znalosti Po úspěšném absolvování předmětu student definuje základní pojmy související s genovou expresí a popisuje jednotlivé úrovně její regulace v eukaryotní buňce. Vysvětluje principy metod používaných ke stanovení genové exprese na úrovni fenotypu, RNA a proteinu. Popisuje princip kvantitativní PCR, reverzní transkripce a relativní kvantifikace exprese genů. Vysvětluje princip práce s reportérovými geny a jejich využití při studiu regulace transkripce. Identifikuje hlavní zdroje experimentálních a systematických chyb při analýze genové exprese a uvádí vztahy mezi aktivitou promotoru, množstvím transkriptu a hladinou odpovídajícího proteinu.
Dovednosti Po úspěšném absolvování předmětu student aplikuje standardní laboratorní postupy při práci s kvasinkovými kulturami a geneticky modifikovanými kmeny. Provádí izolaci RNA, stanovuje její koncentraci, čistotu a integritu a posuzuje vhodnost vzorku pro následné analýzy. Provádí enzymatické odstranění genomové DNA a reverzní transkripci RNA do cDNA. Připravuje a realizuje experiment kvantitativní PCR včetně přípravy ředících řad, technických replikací a kontrol. Vyhodnocuje a interpretuje amplifikační křivky, křivky tání a hodnoty Ct/Cp. Provádí relativní kvantifikaci genové exprese s využitím referenčního genu. Aplikuje metody detekce proteinů (Western blot, měření fluorescence) a porovnává jejich výsledky s daty na úrovni RNA. Analyzuje výsledky růstových testů na selekčních médiích a interpretuje jejich vztah k aktivitě testovaných promotorů.
Kompetence Po úspěšném absolvování předmětu student kriticky hodnotí získaná experimentální data z hlediska jejich biologické relevance a technické spolehlivosti. Porovnává výhody a omezení jednotlivých metod stanovení genové exprese. Integruje výsledky získané na různých úrovních genové exprese (fenotyp, RNA, protein). Formuluje a zdůvodňuje závěry vycházející z experimentálních dat jednotlivce i celé pracovní skupiny a interpretuje výsledky v širším kontextu regulace genové exprese a experimentálního designu
Poslední úprava: Mašek Tomáš, RNDr., Ph.D. (14.01.2026)
Knowledge After successful completion of the course, the student defines fundamental concepts related to gene expression and describes the individual levels of its regulation in eukaryotic cells. The student explains the principles of methods used for the analysis of gene expression at the level of phenotype, RNA, and protein. The student describes the principles of quantitative PCR, reverse transcription, and relative quantification of gene expression. The student explains the principles of reporter genes and their application in the study of transcriptional regulation. The student identifies major sources of experimental and systematic errors in gene expression analysis and describes the relationships between promoter activity, transcript abundance, and the cellular level of the corresponding protein.
Skills After successful completion of the course, the student applies standard laboratory procedures when working with yeast cultures and genetically modified strains. The student performs RNA isolation, determines RNA concentration, purity, and integrity, and evaluates sample suitability for downstream applications. The student performs enzymatic removal of genomic DNA and reverse transcription of RNA into cDNA. The student prepares and carries out quantitative PCR experiments, including the preparation of dilution series, technical replicates, and appropriate controls. The student evaluates and interprets amplification curves, melting curves, and Ct/Cp values. The student performs relative quantification of gene expression using a reference gene. The student applies protein detection methods (Western blot, fluorescence measurement) and compares protein-level data with RNA-level results. The student analyzes growth assays on selective media and interprets their relationship to promoter activity.
Competences After successful completion of the course, the student critically evaluates experimental data with respect to their biological relevance and technical reliability. The student compares the advantages and limitations of individual gene expression analysis methods. The student integrates results obtained at different levels of gene expression (phenotype, RNA, protein). The student formulates and justifies conclusions based on experimental data obtained individually and within a working group, and interprets the results in the broader context of gene expression regulation and experimental design
Poslední úprava: Mašek Tomáš, RNDr., Ph.D. (14.01.2026)
