* 1) Moderní představy o struktuře chromatinu
- Topologicky asociované domény (TADs), domény asociované s laminou (LADs), chromozómová teritoria, funkční význam
* 2) Fluorescenční hybridizace in situ (FISH) - princip a základní protokol
- přímé a nepřímé značení DNA sond pro FISH a jejich detekce (výhody a nevýhody)
- principy metod pro značení sond (nick translace, random priming, DOP PCR, primed in situ (PRINS) labeling aj.)
- vliv formamidu na denaturaci DNA, úloha dalších chemikálií základního protokolu FISH
- rozlišovací schopnost metody FISH, stringence
* 3) Současné markery a metody molekulární cytogenetiky
- tandemové repetice, satelitní DNA (satDNA), Cot DNA, mikrosatelity, transponovatelné elementy (TEs), telomery a vnitřní telomerické sekvence (ITSs), multigenové rodiny (histonové geny, snDNA, rDNA) a jejich informační hodnota při analýze karyotypů
- dynamika a modely evoluce tandemových repetic (concerted evolution, birth-and-death evolution, vliv genové konverze a nerovnoměrného crossing-overu)
- detailnější poziční mapování cytogenetických markerů (fibre-FISH)
- mapování unikátních sekvencí - tyramidová FISH (TSA FISH) a FISH mapující fragmenty zaklonované v bakteriálních artificiálních chromozómech (BAC FISH)
- oligo-paint FISH (příprava sond ke v podstatě jakémukoliv úseku genomu se známou sekvencí)
- malovací sondy (WCP) a jejich vnitrodruhová i mezidruhová (Zoo-FISH) aplikace
- celogenomové sondy- genomová in situ hybridizace (GISH) a komparativní genomová hybridizace (CGH) a jejich využití pro analýzu hybridů, eliminace genomu a pohlavních chromozómů
- využití moderních metod sekvenování (NGS), informací z již publikovaných genomů a z různých databází pro generování nových cytogenetických markerů
- příklady uplatnění molekulární cytogenetiky při řešení mezioborové problematiky (integrace s fylogenetickými analýzami, taxonomií, ekologií, evolucí, genomikou aj.)
* 4) Využití molekulárně cytogenetických metod při analýze pohlavních a B chromozómů
- současné představy o evoluci pohlavních chromozomů; molekulárně cytogenetické metody vhodné pro analýzu vzniku a evoluce pohlavních/neopohlavních a B chromozómů
- neobvyklé a extrémní příklady diferenciace pohlavních chromozómů
- analýza různých fází diferenciace pohlavních chromozomů, detekce a mapování ústředních genů pro determinaci pohlaví (cytogenetické i genomické metody), přechody (turnover) mezi systémy determinace pohlaví
- vznik a evoluce B chromozomů a jejich možné fuknce v organizmu; GRC (germline restricted chromosome)
* 5) Molekulárně cytogenetické metody při analýze polyploidie, hybridizace, asexuální/unisexuální reprodukce a eliminace genomu
- Možnosti molekulární cytogenetiky pro detekci auto- a allopolyploidie u mladších a starších polyploidních událostí, mapování evoluce post-polyploidního genomu, re-diploidizace
- homoploidní vs. alopolyploidní hybridi, unikátní případ opakované hybridizace u jeseterů
- gynogeneze, hybridogeneze (zejména na příkladech ryb a obojživelníků - Ambystoma, Cobitis, Pelophylax)
- eliminace genomu u žab, ryb a hlístic, metody studia
* 6) Molekulárně cytogenetické metody a problematika karyotypové evoluce
- mechanizmy karyotypové evoluce (chromozomové přestavby včetně jejich významu pro vytváření mezidruhových bariér, adaptaci, radiaci; meiotický/centromerický tah)
- trendy karyotypové evoluce u různých skupin organizmů a příklady
- fenomén centromerického posunu (centromere repositioning)
- problematika mikrochromozómů
- polymorfizmy, karyomorfy chromozomové rasy, kryptické druhy
- hybridní zóny, introgrese
- karyotypová konzervativita (stáze)
- zvlášnosti karyotypové evoluce u polyploidních fylognetických linií a linií s holokinetickými chromozomy; mapování konzervované syntenie a její význam pro rekonstrukci ancestrálních karyotypů
- chromothripsis jako potenciální mechanizmus karyotypové evoluce
Poslední úprava: Sember Alexandr, Mgr., Ph.D. (31.08.2022)
Syllabus
1) Current views on the chromatin structure and its topology in the nucleus
- topologically associated domains (TADs), lamin associated domains (LADs), chromosome territories, functional significance
2) Fluorescence in situ hybridization – the principles and the protocol overview
- direct and indirect labeling of FISH probes and probe detection (advantages and limitations)
- principles of probe labeling (nick translation, random priming, DOP PCR, primed in situ labelling (PRINS) etc.)
- effect of formamide on DNA denaturation, the role of other chemical agens in the basic FISH protocol
- the resolution of FISH-based techniques, stringency
3) Current markers and methods of molecular cytogenetics
- tandemly-repeated sequences, satellite DNA (satDNA), Cot DNA, microsatellites, transposable elements (TEs), telomeres and interstitial telomeric sites (ITSs), multigene families (histone genes, snDNA, rDNA) and their bearing to karyotype analysis
- mechanisms and models describing evolutionary dynamics of tandem repeats (concerted evolution, birth-and-death evolution, impact of gene conversion and unequal crossing-over along with recent insights into mechanisms of these phenomena)
- detailed physical mapping of adjacent or co-localized markers (fibre-FISH)
- mapping of single-copy regions – tyramide signal amplification FISH (TSA FISH), BAC (bacterial artificial chromosome) FISH
- oligo-paint FISH
- whole chromosome painting probes (WCP) and their intra- and interspecific (Zoo-FISH) application
- FISH with probes derived from whole genomic DNA- genomic in situ hybridization (GISH) and comparative genomic hybridization (CGH)
- utilization of next generation sequencing (NGS), available genomic data and particular databases for generation of new cytogenetic markers
- examples of integrated approach combining cytogenetic methods with data of other (phylogenetic, taxonomic, ecological, evolutional, genomic) approaches
4) Application of molecular cytogenetics in analyses of specialized chromosomes
- methods suitable for deciphering the emergence and evolution of sex/neo-sex chromosomes and B chromosomes, with emphasis on specific cases (Rumex, Drosophila, Orthoptera, Lepidoptera, spiders, fishes, frogs, reptiles, marsupials)
- unusual and extreme cases of sex chromosome differentiation
- methods suitable for unmasking master sex determining genes (or other sex-linked genetic content) including state-of-the-art sequencing and bioinformatic tools
- turnover of sex chromosomes and its high rate in cold-blooded vertebrates
5) Contribution of molecular cytogenetics to research of polyploidy, hybridization, asexual/unisexual reproduction and genome elimination
- applications and resolution power for resolving between auto- vs. allopolyploidy scenario in recent and older evolutionary events; evolutionary dynamics of post-polyploid genome restructuring, re-diploidization
- homoploid vs. allopolyploid hybrids, unique case of recurrent hybridization in sturgeons
- gynogenesis, hybridogenesis (with special emphasis on fishes and amphibians - Ambystoma, Cobitis, Pelophylax)
- genome elimination in frogs, fishes and nematods and associated battery of suitable methods for its investigation
6) Molecular cytogenetics and karyotype evolution
- mechanisms of karyotype evolution (chromosome rearrangements and their impact on reproductive isolation, karyotype orthoselection, meiotic/centromeric drive)
- trends of karyotype evolution in particular taxonomic groups (with emphasis on typical as well as outstanding examples)
- centromere repositioning
- microchromosomes
- polymorphisms, karyomorphs, chromosome races, cryptic species
- hybrid zones, introgression
- karyotype stasis
- unique patterns of karyotype evolution in polyploids and taxa with holocentric chromosomes
- mapping of conserved synteny and its bearing to reconstruction of ancestral karyotypes
- chromothripsis as a potential driving force behind karyotype evolution
Poslední úprava: Lichá Irena, RNDr., CSc. (29.05.2018)