Cytometrie - MB151P80

• Anglický název: Cytometry
• Český název: Cytometrie
• Zajišťuje: Katedra buněčné biologie (31-151)
• Fakulta: Přírodovědecká fakulta
• Platnost: od 2022 do 2022
• Semestr: zimní
• E-Kredity: 4
• Způsob provedení zkoušky: zimní s.:
• Rozsah, examinace: zimní s.:2/1, Z+Zk [HT]
• Počet míst: 25
• Minimální obsazenost: neomezen
• Virtuální mobilita / počet míst: ne
• Stav předmětu: vyučován
• Jazyk výuky: čeština
• Vysvětlení: Předmět je neslučitelný s anglickou paralelkou. Prosím, přihlašte se do Moodle kurzu (e-learning) vpravo
• Poznámka: povolen pro zápis po webu
• Garant: RNDr. Karel Drbal, Ph.D.
• Vyučující: RNDr. Karel Drbal, Ph.D.
• Neslučitelnost : MB151P80E
• Je neslučitelnost pro: MB151P80E

Anotace

Poslední úprava: RNDr. Nataša Šebková, Ph.D. (21.02.2018)

Student bude provedený základní klasifikací cytometrických metod s jejich historickým kontextem. Technologické výhody a nevýhody jednotlivých vývojových směrů cytometrie budou dokumentované na aplikacích ve více oborech: imunologii, reprodukční biologii, botanice, mikrobiologii, protistologii, hydrobiologii, molekulární biologii, genetice a biomedicíně obecně. Součástí jsou i praktická cvičení ve 4 tematických celcích (á 3 hodiny):
- design experimentu
- příprava vzorku a měření multiparametrických dat
- analýza dat (základní)
- analýza dat (pokročilá)

Aplikační využití cytometrie zahrnuje široké vědecké postupy a experimenty: analýzu a třídění různých velikostí částic od submikronových (chromozomů, bakterií, organel a vesiklů) přes buňky do velikosti stovek mikronů, ale i celých organismů až do velikosti 1mm. Analýza se neomezuje pouze na statické jednoparametrické "screeningové" experimenty, ale hlavní síla cytometrie je v multiparametrické analýze heterogenních vzorků a jejich funkčních vlastností. S objevem nových fluorochromů, včetně různých variant fluorescenčních proteinů, dnes můžeme studovat funkční projevy buněk až na úrovni protein-protein interakcí.
Vlastní cytometry i cytometrická data jsou velmi komplexní, plně standardizované a umožňují nám použití robustních statistických metod pro jejich analýzu. Součástí předmětu je proto praktická ukázka a detailní procvičení analýzy dat. Důraz klademe hlavně na průtokovou cytometrii. Další varianty cytometrie, včetně obrazové, budou probírané, ale nebudou předmětem vlastních praktických cvičení.

Literatura

Poslední úprava: RNDr. Karel Drbal, Ph.D. (05.06.2022)

Pro začátečníky:
GIVAN, Alice. L.: Flow Cytometry: First Principles, Wiley-Liss, New York, 2001, ISBN-13: 978-0471382249
ORMEROD, Michael. G.: Flow Cytometry - A Basic Introduction, http://flowbook.denovosoftware.com/

Pro středně pokročilé:
DARZYNKIEWICZ, Zbygniew et al.: Methods In Cell Biology, Vol. 103: Recent Advances in Cytometry, Part A, Academic Press, Amsterdam, 2011.
DOLEŽEL, Jaroslav et al.: Flow Cytometry with Plant Cells. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2007, ISBN-13: 978-3527314874

Pro experty:
SHAPIRO, Howard. M.: Practical Flow Cytometry, 4th Edition. John Wiley and Sons, Inc., New York, 2003, ISBN-13: 978-0471411253, dostupné: https://media.beckman.com/-/media/pdf-assets/ebooks/flow-cytometers-ebook-practical-flow-cytometry.pdf
Coursera: MOUNT SINAI Experimental Methods in Systems Biology

Metodické učebnice a návody:
ROBINSON, J. Paul. et al.: Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, New York, 2003, ISBN-13: 978-0471142959

Požadavky ke zkoušce

Poslední úprava: RNDr. Karel Drbal, Ph.D. (13.10.2021)

Akademický rok 2021/2022: výuka probíhá prezenčně. Materiály a další info dostupné prostřednictvím systému Moodle.

Zápočet se skládá z:
- absolvování tří domácích testů po každé praktické hodině, které proběhnou v Moodlu. Musíte získat alespoň 50% bodů v součtu.
- závěrečného testu během přednáškového dne. Jedná se o krátký single best answer test na Moodlu. Absolvování tohoto závěrečného testu alespoň na 50% je podmínkou pro připuštění k vlastní zkoušce.

Vlastní zkouška se skládá z odevzdání tří částí dokumentů na Moodle (do 31.5. 23:55), kdy můžete získat 100% možných bodů. Za každý další den prodlení se odečítá 1% z předchozího dne progresivně až do termínu prezentace během 2. červnového týdne. Následně budete prezentovat svoje výsledky formou 10 minutové prezentace pouze části 1 před ostatními studenty, kteří vás budou hodnotit. Finální známku nicméně určuje lektor s přihlédnutím k vašemu hodnocení, dalším částem zkoušky a svoje rozhodnutí všem zdůvodní.

Tyto tři části se skládají z:

1/  Reportu společně provedeného experimentu = posouzení správnosti jeho návrhu, provedení vlastního měření a analýzy dat. Odevzdáte na Moodle dokument ve formátu projektového reportu. Vlastní experiment provedeme během praktického kurzu č.3 = max. 45 bodů. Tento report bude následně přednesen během 10 minut v krátkém sdělení s diskuzí - během přednáškového dne na začátku června.
2/ Návrh Vašeho vlastního experimentu pro skutečně plánovaný nebo fiktivní projekt - uvedení do problematiky včetně citací, správný výběr cytometru a fluorochromů/prób včetně spektrální analýzy, odůvodnění metod měření a analýzy dat a popis očekávaných výsledků - styl krátkého projektu - do 4 A4 stránek = max. 45 bodů
3/ volitelné heslo pro Wikipedii v angličtině na cytometrické téma, včetně 3-5 souvisejících a obecných citací = max. 10 bodů / nutné zalogování do Wikipedie pod Vaším účtem, který si zaregistrujete v nástěnce Wikipedie na https://outreachdashboard.wmflabs.org/.

Klasifikace: každá část zkoušky je hodnocená separátně a celková známka je stanovená podle UK pravidel (stupnice 1-4):

    100-94 bodů = A (excelentní - summa cum laude); v UK systému = 1
    93-80 bodů = B (výborně - insigni cum laude); v UK systému = 1
    79-60 bodů = C (velmi dobře - magna cum laude); v UK systému = 2
    59-47 bodů = D (dobře - cum laude); v UK systému = 3
    46-40 bodů = E (prospěl/a - rite); v UK systému = 3

U hraničních výsledků (77 - 79, 57 - 59, 37 - 39) bude provedeno dodatečné ústní přezkoušení.

Sylabus

Poslední úprava: RNDr. Karel Drbal, Ph.D. (09.02.2020)

Předmět Cytometrie je vyučován ve 4 cyklech, kdy v každém z nich je série 3 dvouhodinových přednášek (1,5 hodiny čistého času) vždy zakončená jedním praktickým 3-hodinovým cvičením (2 a 1/4 hodiny čistého času), a to ihned po poslední přednášce v dané sérii.

1. cyklus: Základy cytometrie

PŘEDNÁŠKY:

1. Základy cytometrické technologie - termíny a kus historie (J. Doležel)
Klasifikace cytometrických technik, cytomika. Průtoková cytometrie, historie, parametry měřitelné pomocí průtokové cytometrie, základní části průtokového cytometru. Fluidika, laminární proudění, průtoková komůrka, hydrodynamická fokusace, principy sortingu.

2. Elektronika a optika cytometrů, metodiky třídění částic (J. Doležel)
Zdroje světla, rtuťové výbojky a lasery, optické filtry. Detekce světelných pulzů, fotodiody a fotonásobiče, parametry světelného pulzu. Zesilovače signálu, digitální zpracování signálů, kompenzace fluorescence, typy zobrazení výsledků analýzy. Cytometrické třídění, používaná konstrukční řešení a aplikace třídění (sorting).

3. Základy aplikací průtokové cytometrie - fokus na rostliny (J. Doležel)
Úvod do analýzy dat - obsah jaderné DNA, stanovení ploidie, určení velikost jaderného genomu, identifikace mezidruhových hybridů, detekce aneuploidie, určení způsobu reprodukce, analýza kinetiky buněčného cyklu, apoptóza, endoreduplikace, třídění buněčných jader a mitotických chromozómů, analýza protoplastů, analýza chloroplastů, analýza genové exprese, studium fytoplanktonu, fytopatologie.

PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Základy praktické analýzy dat
What you see is what you get: analýza DNA, kvalita dat, datové standardy, rozlišení a distribuce dat, škálování, transformace, základní způsoby zobrazování, představení open source SW pro základní způsob analýzy (FCSalyzer, Flowing Software, příp. Summit, WinMDI), komplexní SW balíky (SW: FlowJo, BC Kaluza, BD DiVa) a otevřená platforma R.

 2. cyklus: Základní cytometrické aplikace

PŘEDNÁŠKY:

4. Klinická cytometrie (T. Kalina)
Standardizace přístrojů a dat - klinická cytometrie budoucnosti, EUROFLOW, Multispektrální a hmotnostní cytometrie, Alternativy klasického flow sortingu v klinice

5. Použití cytometrie v  biotechnologiích a v biomedicíně (K. Drbal)
Malé fluorochromy, tandemy, FRET a fluorescenční proteiny, senzory.
Selekční metody producentů v biotechnologiích, environmentální analýza, vazba na -omics metodiky.
Imunofenotypizace buněk a tkání: imunitní odpověď, nádory, infekce, mikrovesikly/mikropartikule.

6. Funkční testy v cytometrii (K. Drbal)
Apoptóza, proliferace, signalizace, membránový potenciál, kinetické testy, vzácné populace, metabolismus ..

PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Návrh experimentu
Návrh experimentu a limity cytometrické metodiky (statistika a pozadí - rare cell, autofluorescence, kompenzace, základy kombinací fluorochromů, návrh panelů protilátek) a teorie vlastní přípravy vzorku (pevné tkáně, bakterie, kvasinky, viry, biosafety regulace)

 3. cyklus: Cytometrické aplikace v klinice

PŘEDNÁŠKY:

7. Standardní cytometrická diagnostika v onkologii (E. Mejstříková)
Ontogeneze a onkogeneze - krvetvorba a leukémie, kmenové buňky, stratifikace onkologických pacientů.

8. Funkční studie imunitního systému a kuličková proteomika v klinice (V. Kanderová)
Bazotest, Fagotest, testy proliferace, aktivace, detekce Ag - specifických buněk, degranulace NK buněk, cytotoxicity, cytokinů a jiných proteinů (bead assays), signalizace (Phospho-Flow), testy senzitivity / rezistence buněk na léčiva, funkční důsledky aberací zjištěných při celogenomovém sekvenování.

9. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Příprava vzorku a měření multiparametrických dat 

Příprava osmibarevného panelu monoklonálních protilátek dle doporučení EUROFLOW, značení a měření vzorku krve na 8-barevném cytometru BDFACSVerse (plus jednom dalším s více detektory = LSR-II, CytoFLEX S), zpracování reportu (do poslední praktické hodiny)

4. cyklus: Cytometrická budoucnost 

PŘEDNÁŠKY:

10. Základní principy analýzy multiparametrických dat (K. Drbal)
Kompenzace dat, vizualizace, škálování, transformace, normalizace

11. Nové technologie v cytometrii, sortování a jeho nové aplikace v různých disciplínách (K. Drbal)
Mikrofluidika, fluorescenční próby, obrazová cytometrie, alternativy sortování v klinické praxi, sortování producentů v biotechnologiích.

12. Pokročilá analýza dat a pokročilé nástroje multivariantní analýzy se zaměřením na open source (K. Fišer)
Distribuce dat, klastrová analýza, redukce dimensionality (PCA, SNE), CytoBank, R, atd.

PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Práce s naměřenými daty
Použití komerčního SW (FlowJo, Kaluza, CytExpert) pro supervizovanou analýzu a R nástrojů pro nesupervizovanou analýzu naměřených dat, kontrola kvality naměřených dat, způsob jejich hodnocení, reportování, troubleshooting...