PředmětyPředměty(verze: 953)
Předmět, akademický rok 2023/2024
   Přihlásit přes CAS
Cytometrie - MB151P80
Anglický název: Cytometry
Český název: Cytometrie
Zajišťuje: Katedra buněčné biologie (31-151)
Fakulta: Přírodovědecká fakulta
Platnost: od 2023
Semestr: zimní
E-Kredity: 4
Způsob provedení zkoušky: zimní s.:
Rozsah, examinace: zimní s.:2/1, Z+Zk [HT]
Počet míst: 25
Minimální obsazenost: neomezen
4EU+: ne
Virtuální mobilita / počet míst pro virtuální mobilitu: ne
Stav předmětu: vyučován
Jazyk výuky: čeština
Vysvětlení: Předmět je neslučitelný s anglickou paralelkou (letní semestr).Prosím, přihlašte se do Moodle kurzu (e-learning) vpravo
Poznámka: povolen pro zápis po webu
Garant: RNDr. Karel Drbal, Ph.D.
Vyučující: RNDr. Karel Drbal, Ph.D.
Neslučitelnost : MB151P80E
Je neslučitelnost pro: MB151P80E
Anotace
Student bude provedený základní klasifikací cytometrických metod s jejich historickým kontextem. Technologické výhody a nevýhody jednotlivých vývojových směrů cytometrie budou dokumentované na aplikacích ve více oborech: imunologii, reprodukční biologii, botanice, mikrobiologii, protistologii, hydrobiologii, molekulární biologii, genetice a biomedicíně obecně.

Součástí je i práce s daty a praktická cvičení ve 4 tematických celcích (á 3 hodiny):
- analýza dat (základní)
- návrh experimentu
- příprava vzorku a měření multiparametrických dat
- reportování a analýza dat (pokročilá)

Aplikační využití cytometrie zahrnuje široké vědecké postupy a experimenty: analýzu a třídění různých velikostí částic od submikronových (chromozomů, bakterií, organel a vesiklů) přes buňky do velikosti stovek mikronů, ale i celých organismů až do velikosti 1mm. Analýza se neomezuje pouze na statické jednoparametrické "screeningové" experimenty, ale hlavní síla cytometrie je v multiparametrické analýze heterogenních vzorků a jejich funkčních vlastností. S objevem nových fluorochromů, včetně různých variant fluorescenčních proteinů, dnes můžeme studovat funkční projevy buněk až na úrovni protein-protein interakcí. Proto se stala cytometrie jedním ze stavebních bloků systémové biologie a umožňuje nám měřit desítky parametrů na miliónech buněk současně.

Technologie cytometrie i vlastní cytometrická data jsou velmi komplexní, plně standardizovaná a umožňují nám použití robustních statistických metod pro jejich analýzu. Součástí předmětu je proto praktická ukázka a detailní procvičení analýzy dat. Důraz je kladený hlavně na klasickou fluorescenční průtokovou cytometrii. Další varianty cytometrie, včetně hmotnostní a obrazové, budou probírané, ale nebudou předmětem vlastních praktických cvičení.

Absolventi budou mít po složení zápočtu a zkoušky:
- znalost principů jednotlivých směrů cytometrie
- znalost o funkci přístrojů a souvisejícím využití vhodných fluorochromů a prób
- znalost o stávajících aplikacích průtokové cytometrie v širokém spektru vědních oborů
- schopnost posoudit vhodnost zvolené metody při řešení konkrétního problému
- schopnost analyzovat a interpretovat výsledky získané průtokovou cytometrií
- schopnost kriticky hodnotit kvalitu cytometrických dat ve vědeckých publikacích

Poslední úprava: Drbal Karel, RNDr., Ph.D. (31.08.2023)
Literatura

Pro začátečníky:
GIVAN, Alice. L.: Flow Cytometry: First Principles, Wiley-Liss, New York, 2001, ISBN-13: 978-0471382249
ORMEROD, Michael. G.: Flow Cytometry - A Basic Introduction, http://flowbook.denovosoftware.com/

Pro středně pokročilé:
DARZYNKIEWICZ, Zbygniew et al.: Methods In Cell Biology, Vol. 103: Recent Advances in Cytometry, Part A, Academic Press, Amsterdam, 2011.
DOLEŽEL, Jaroslav et al.: Flow Cytometry with Plant Cells. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2007, ISBN-13: 978-3527314874

Pro experty:
SHAPIRO, Howard. M.: Practical Flow Cytometry, 4th Edition. John Wiley and Sons, Inc., New York, 2003, ISBN-13: 978-0471411253, dostupné: https://media.beckman.com/-/media/pdf-assets/ebooks/flow-cytometers-ebook-practical-flow-cytometry.pdf
Coursera: MOUNT SINAI: Experimental Methods in Systems Biology

Metodické učebnice a návody:
ROBINSON, J. Paul. et al.: Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, New York, 2003, ISBN-13: 978-0471142959

Během kurzu dostanete i odkazy na výuková videa a MOOC kurzy, které doporučuji.

Poslední úprava: Drbal Karel, RNDr., Ph.D. (31.08.2023)
Požadavky ke zkoušce

Výuka probíhá prezenčně. Materiály a další info dostupné prostřednictvím LMS systému Moodle.

Zápočet se skládá z:
- absolvování tří domácích testů po praktických hodinách, které proběhnou v Moodlu. Musíte získat alespoň 50% bodů v součtu.
- závěrečného prakticky orientovaného testu během přednáškového dne. Jedná se o krátký "multiple choice" test na Moodlu. Absolvování tohoto závěrečného testu alespoň na 50% je podmínkou pro připuštění k vlastní zkoušce.

Tři části zkoušky se skládají z:

1/ Reportu společně zadaného reálného experimentu = posouzení správnosti jeho návrhu, provedení vlastního měření a analýzy dat. Odevzdáte na Moodle dokument ve formátu projektového reportu s komentářem, co se Vám podařilo a co nikoli. Max. 45 bodů
2/ Návrhu Vašeho vlastního experimentu pro plánovaný nbo fiktivní projekt na základě Vámi zvoleného tématu, které Vas zajímá, použijete vzor z literatury - uvedení do problematiky včetně citací, správný výběr cytometru a fluorochromů/prób včetně spektrální analýzy, odůvodnění metod měření a metod analýzy dat a popis očekávaných výsledků - styl krátkého projektu - do 4 A4 stránek = max. 45 bodů.
3/ volitelného hesla pro Wikipedii na cytometrické téma (alespoň 5000 bytů) v češtině nebo angličtině, včetně 3-5 souvisejících a obecných citací = max. 10 bodů / nutné zalogování do Wikipedie pod Vaším účtem, který si zaregistrujete v nástěnce Wikipedie na https://outreachdashboard.wmflabs.org/.

Vlastní zkouška se skládá z odevzdání dokumentů (Report a Návrh experimentu) na Moodle (týden před zkouškou), kdy můžete získat 100% možných bodů. Za každý další den prodlení se odečítá 1% z předchozího dne progresivně až do termínu Vaší prezentace během prvního až druhého únorového týdne. Na jednom termínu zkoušky se musí shodnout všichni studenti.
Na základě hodnocení a poznámek lektora upravíte během týdne Vaši prezentaci. Budete prezentovat svoje výsledky formou 10-minutové prezentace Reportu a Návrhu experimentu před ostatními studenty, kteří vás též budou hodnotit a také s Vámi diskutovat.
Finální známku nicméně určuje lektor s přihlédnutím k vašemu hodnocení, dalším částem zkoušky a svoje rozhodnutí všem písemně zdůvodní.

Vzorové provedení Reportu a Návrhu experimentu bude poskytnuté v rámci výuky.

Klasifikace: každá část zkoušky je hodnocená separátně a celková známka je stanovená podle UK pravidel (stupnice 1-4):

    100-94 bodů = A (excelentní - summa cum laude); v UK systému = 1
    93-80 bodů = B (výborně - insigni cum laude); v UK systému = 1
    79-60 bodů = C (velmi dobře - magna cum laude); v UK systému = 2
    59-47 bodů = D (dobře - cum laude); v UK systému = 3
    46-40 bodů = E (prospěl/a - rite); v UK systému = 3

U hraničních výsledků (77 - 79, 57 - 59, 37 - 39) bude provedeno dodatečné ústní přezkoušení ihned během zkušebního dne.

Poslední úprava: Drbal Karel, RNDr., Ph.D. (31.08.2023)
Sylabus

Předmět Cytometrie je vyučován ve 4 cyklech, kdy v každém z nich je série 3 dvouhodinových přednášek (1,5 hodiny čistého času) vždy zakončená jedním praktickým 3-hodinovým cvičením (2 a 1/4 hodiny čistého času), a to ihned po poslední přednášce v dané sérii.

1. cyklus: Základy cytometrie

PŘEDNÁŠKY:

1. Základy cytometrické technologie - termíny a kus historie
Klasifikace cytometrických technik - ruzné druhy detekce jednotlivých částic až po cytomiku (průtoková, hmotnostní, obrazová, -omics kombinace). Historie, parametry měřitelné pomocí průtokové cytometrie, základní části průtokového cytometru. Fluidika, laminární proudění, průtoková komůrka, hydrodynamická fokusace, principy sortingu.
Elektronika a optika průtokových cytometrů -
zdroje světla, rtuťové výbojky a lasery, optické filtry. Detekce světelných pulzů, fotodiody a fotonásobiče, parametry světelného pulzu. Zesilovače signálu, digitální zpracování signálů, kompenzace fluorescence, typy zobrazení výsledků analýzy. 

2. Jednoduché aplikace průtokové cytometrie
Úvod do analýzy dat - obsah jaderné DNA, stanovení ploidie, určení velikost jaderného genomu, identifikace mezidruhových hybridů, detekce aneuploidie, určení způsobu reprodukce, analýza kinetiky buněčného cyklu, apoptóza, endoreduplikace, analýza genové exprese, studium fytoplanktonu.

3. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Základy praktické analýzy dat
Představení open source SW pro základní způsob analýzy (FCSalyzer, příp. Flowing Software), komplexní SW balíky (SW: FlowJo, BC Kaluza, BD DiVa) a otevřená platforma R.
What you see is what you get: datové standardy, kvalita dat, čištění dat, rozlišení a distribuce dat, škálování, transformace, základní způsoby zobrazování, jedno- a víceparametrická analýza DNA. 

Zápočtový test #1

 

2. cyklus: Základní cytometrické aplikace

PŘEDNÁŠKY:

4. Principy fluorochromů a praktické využití cytometrie v biotechnologiích a v biomedicíně
Zopakování předchozí praktické části s důrazem na standardizaci a reproducibilitu měření.
Malé fluorochromy a fluorescenční proteiny, FRET (fluorescenční přenos energie) - tandemy a biosenzory.
Selekční metody producentů v biotechnologiích, environmentální analýza, vazba na -omics metodiky.

5. Opakování, korelace měření a zobrazení dat
Opakování optiky: 3 osy v průtokové cele cytometru, laser delay, excitace a emise fluorochromů (emise fotonů a průchod optickými filtry a dichroickými zrcadly), prohlížeče spekter ("spectra viewer"), detektory (fotodiody, fotonásobiče, APD), zesilovače signálu.
Analýza dat: parametry a detekce světelných pulzů, digitální zpracování signálu, nutnost kompenzace přesvitu fluorescence, typy zobrazení výsledků analýzy (1D, 2D, 3D, 4D-kinetika, multiD včetně vysvětlení redukce dimenzionality).

Funkční testy v cytometrii
Apoptóza, proliferace, signalizace, membránový potenciál, kinetické testy, vzácné populace, metabolismus.
Imunofenotypizace buněk a tkání: imunitní odpověď, nádory,
infekce, mikrovesikly/mikropartikule.

6. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Návrh experimentu
Návrh experimentu (který provedeme ve 3. praktické hodině) a limity cytometrické metodiky (statistika a pozadí - rare cell, autofluorescence, kompenzace, základy kombinací fluorochromů, návrh panelů protilátek) a teorie vlastní přípravy vzorku (pevné tkáně, bakterie, kvasinky, viry, "biosafety“ regulace)

 

3. cyklus: Detailní analýza a měření dat

PŘEDNÁŠKY:

7. Návod pro analýzu dat (titrace / voltrace)
Ukázka analýzy vzorových titrovaných dat, měření titrovaných vzorků.

8. Práce s reálnými daty
Kalkulace SI v FCSalyzeru, příprava reportu

Zápočtový test #2

9. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Příprava vzorku a měření multiparametrických dat
Příprava osmibarevného panelu monoklonálních protilátek dle doporučení EUROFLOW, značení a měření vzorku krve na 8-barevném cytometru BDFACSVerse (plus jednom dalším s více detektory = LSR-II, CytoFLEX S).

 

4. cyklus: Analýza multiparametrických dat 

PŘEDNÁŠKY:

10. Základní principy analýzy multiparametrických dat (FlowJo – úvod)
Kompenzace dat, vizualizace, škálování, transformace, normalizace. Určení populací, FMO kontroly a kontroly obecně, konkatenace souborů, grafické a statistické výstupy ve FlowJo

11. Nácvik kompenzace dat (FlowJo)

12. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Práce s naměřenými daty
Použití komerčního SW (FlowJo) pro supervizovanou analýzu a R nástrojů pro nesupervizovanou analýzu naměřených dat, kontrola kvality naměřených dat, způsob jejich hodnocení, reportování, řešení problémů... příprava ke zkoušce

Zápočtový test #3

Poslední úprava: Drbal Karel, RNDr., Ph.D. (31.08.2023)
 
Univerzita Karlova | Informační systém UK