Prezentace, odkazy na přednášky a další materiály budou k dispozici na Moodle https://dl2.cuni.cz/course/view.php?id=283
Přednáška nabízí přehled širokého spektra laboratorních metod používaných v současné molekulární a buněčné biologii. Předpokládají se základní znalosti molekulární biologie, biologie buňky a genového inženýrství.
Poslední úprava: Čáp Michal, RNDr., Ph.D. (06.01.2026)
The class reviews current methods used in molecular and cellular biology. The topics cover a broad spectrum of methods from genome editing methods, nucleic acids sequencing and manipulation, protein detection and identification, use of fluorescent probes and proteins to modern microscopic techniques. Basic understanding of molecular and cellular biology and genetic engeneering is required.
Poslední úprava: Čáp Michal, RNDr., Ph.D. (23.10.2019)
Literatura -
Předmět má přiřazen stejnojmenný kurz v systému Moodle 2(Moodle UK pro výuku 2\Přírodovědecká fakulta\sekce Biologie\Katedra genetiky a mikrobiologie\Metody v molekulární a buněčné biologii). Klíč vyžadovaný k přihlášení je sdělen na přednášce. K dispozici jsou zde prezentace z přednášek a případná doporučená literatura.
Poslední úprava: Čáp Michal, RNDr., Ph.D. (20.03.2017)
The presentations from class and recomended literature sources are aviable in Moodle 2 (Moodle UK pro výuku 2\Přírodovědecká fakulta\sekce Biologie\Katedra genetiky a mikrobiologie\Metody v molekulární a buněčné biologii). Password is provided on the first lesson or upon request of the teacher.
Poslední úprava: Čáp Michal, RNDr., Ph.D. (23.10.2019)
Požadavky ke zkoušce -
Zkouška se skládá formou písemného testu. Čas na vypracování je 70 minut. Obsahuje otázky k zodpovězení vlastní formulací, otázky zaškrtávací typu multiple choice a jeden praktický problém k vyřešení.
Poslední úprava: Čáp Michal, RNDr., Ph.D. (06.01.2026)
The course is accomplished by examination in written form. The test consist of 20 questions. Each question is evaluated with 0-2 points.
grading:
34-40 ...1 27-33 ...2 >20-26 ...3 <=20 ... 4
Poslední úprava: Čáp Michal, RNDr., Ph.D. (23.10.2019)
Sylabus -
Genomové manipulace a reverzní genetika Selekční a reportérové geny, nástroje pro manipulaci s genomem (místně specifické rekombinázy, místně specifické endonukleázy, homologní rekombinace) reverzní genetika - náhodná inaktivace genu (transpozonová mutageneze, TILLING, genová past), cílená inaktivace genu (knock-out, RNA-interference), regulovaná exprese genu.
Genomové modifikace u modelových organizmů Charakteristika a specifika modelových organismů molekulární biologie (E. coli, S. cerevisie, D. melanogaster, C. elegans, A. thaliana, myš, člověk - tkáňové kultury), vytváření knock-outů, podmíněných knock-outů, knock-inů, metody transformace, vektory.
Genové modifikace člověka - genová terapie In vivo a ex vivo genová terapie, kmenové buňky, klonování, indukované pluripotentní buňky, virové vektory pro genovou terapii (retrovirové, adenovirové, AAV), jejich produkce, nevirové vektory (transpozonové), metody transfekce, design polymerních nosičů DNA, přístupy genové terapie (exprese funkční alely genu, exprese sebevražedného genu, snížení exprese genu, oprava poškozeného genu), antisense terapie.
Sekvenace DNA Chronologický pohled na sekvenační metody (metoda chemické degradace, dideoxy metoda, pyrosekvenování, metody druhé generace (454, Illumina, Ion Torrent),metody třetí generace (PacBio), sekvenace de novo vs. resekvenace, sekvenace exomu, postup sekvenace genomů, genomové projekty.
Metody studia genové exprese Metody studia exprese jednotlivých genů: EST, Northern blot, qRT-PCR (kinetika PCR, hodnota Ct, sondy pro detekci, normalizace, efektivita PCR). Metody studia transkriptomu: DNA čipy (princip, prezentace výsledků: teplotní mapy, clusterování; dlaší oblasti použití DNA čipů), sekvenace RNA (RNA-Seq).
Metody studia proteinů Stanovení koncentrace proteinů, separace: PAGE (denaturační, nativní), barvení, Izolace a purifikace proteinů s využitím afinitních tagů, imunoznačení-protilátky (primární, sekundární, způsoby detekce, výroba), imunoprecipitace, Western blot, ELISA, metody stanovení protein-proteinových interakcí na úrovni jednotlivých proteinů (pull-down assay, proximity ligation assay) i celého proteomu (koimunoprecipirace, TAP, 2-hybridový systém, komplementační assay, phage display), degron, protein arrays (analytický vs. funkční čip).
Proteomika hmotnostní spektrometrie: separace, ionizační techniky, typy analyzátorů, tandemová MS.
Fluorescence a fluorescenční značení Základy fluorescence, filtry a zdroje světla, fluorescenční značení buněk a organel, použití fluorescenčních sond, fluorescenční sondy pro měření vnitrobuněčného pH, koncentrace iontů, membránového potenciálu. Fluorescenční mikroskop, konfokální mikroskop a dvoufotonový konfokální mikroskop. Zelený fluorescenční protein (GFP) a jeho varianty. Možnosti využití fluorescenční proteinů, FRET, FRAP,FLIM.
Pokročilé mikroskopické techniky Atomic force microscopy, mikroskopie blízkého pole, TIRM, fluorescenční mikroskopie s vysokým rozlišením (4Pi, STED, PALM/STORM).
Metody budoucnosti Sekvenace DNA třetí generace (sekvenace nanopórem a další vyvíjené techniky), single-cell techniky (laserová mikropreparace, optická pinzeta, magnetická pinzeta), DNA origami a DNA nanoarray, lab-on-chip - mikrofluidní čipy.
Poslední úprava: Čáp Michal, RNDr., Ph.D. (06.01.2026)
Genome manipulations and reverse genetics
Selection and reporter genes, tools for genome manipulation (site-specific recombinases, site-specific endonucleases, homologous recombination)
reverse genetics - random gene inactivation (transposon mutagenesis, TILLING, gene trap), targeted gene inactivation (knock-out, RNA-interference), regulated gene expression.
Genomic modifications in model organisms
Characteristics and specifics of model organisms of molecular biology (E. coli, S. cerevisia, D. melanogaster, C. elegans, A. thaliana, mouse, human - tissue culture), creation of knock-out, conditional knock-out, knock-in, transformation methods, vectors.
Human gene modifications - gene therapy
In vivo and ex vivo gene therapy, stem cells, cloning, induced pluripotent cells, viral vectors for gene therapy (retroviral, adenoviral, AAV), their production, non-viral vectors (transposon), transfection methods, polymer carrier DNA design, gene therapy approaches (expression of functional allele of gene, expression of suicide gene, decrease of gene expression, repair of damaged gene), antisense therapy.
DNA sequencing
Chronological view of sequencing methods (chemical degradation method, dideoxy method, pyrosequencing, second generation methods (454, Illumina, Ion Torrent), third generation methods (PacBio), de novo vs. re-sequencing, exome sequencing, genome sequencing, genomic projects .
Methods of gene expression studies
Methods of study of individual gene expression: EST, Northern blot, qRT-PCR (PCR kinetics, Ct value, probes for detection, normalization, PCR efficiency).
Methods of study of transcriptome: DNA chips (principle, presentation of results: temperature maps, clustering; particular areas of use of DNA chips), RNA sequencing (RNA-Seq).
Protein study methods
Protein concentration determination, separation: PAGE (denaturing, native), staining, protein isolation and purification using affinity tags, immunolabeling-antibodies (primary, secondary, detection, production), immunoprecipitation,
Western blot, ELISA, methods of determination of protein-protein interactions at the level of individual proteins (pull-down assay, proximity ligation assay) and whole proteome (coimmunoprecipulation, TAP, 2-hybrid system, complement assay, phage display), degron, protein arrays ( analytical vs. functional chip).
Proteomics
mass spectrometry: separation, ionization techniques, types of analyzers, tandem MS.
Fluorescence and fluorescent labeling
Fundamentals of fluorescence, filters and light sources, fluorescent labeling of cells and organelles, use of fluorescent probes, fluorescent probes for measuring intracellular pH, ion concentration, membrane potential.
Fluorescence microscope, confocal microscope and two-photon confocal microscope. Green fluorescent protein (GFP) and its variants. Possibilities of using fluorescent proteins, FRET, FRAP, FLIM.
Flow cytometry.
flow cytometer and cell sorter, principle of measurement, dot plot, population gateway, multicolour flow cytometry, mass cytometry.
Advanced microscopic techniques
Atomic force microscopy, near field microscopy, TIRM, high resolution fluorescence microscopy (4Pi, STED, PALM / STORM).
Methods of the future
Third-generation DNA sequencing (nanopore sequencing and other techniques developed), single-cell techniques (laser micropreparation, optical tweezers, magnetic tweezers), DNA origami and DNA nanoarray, lab-on-chip microfluidic chips.
Poslední úprava: Čáp Michal, RNDr., Ph.D. (24.10.2019)
Výsledky učení
Po úspěšném absolvování předmětu:
·Vysvětlete mechanismy moderních nástrojů pro editaci genomu (CRISPR/Cas9, TALENs, ZFNs) a rozlište jejich specifické aplikace a přednosti.
·Navrhněte využití místně specifických rekombináz (systémy Cre-LoxP, Flp-FRT) pro tvorbu tkáňově specifických nebo indukovaných modifikací.
·Porovnejte rozdíly mezi trvalou inaktivací genu (knock-out) a dočasným umlčením exprese pomocí RNA interference (knock-down).
·Aplikujte znalosti o selekčních a reportérových genech (GFP, luciferáza) při designu experimentů sledujících lokalizaci proteinů nebo aktivitu promotorů.
·Zdůvodněte výběr konkrétního modelového organismu (od kvasinek po savčí modely) pro řešení daného biologického problému s ohledem na genetickou manipulovatelnost a biologickou relevanci.
·Sestavte strategii genové terapie pro konkrétní onemocnění, včetně volby mezi in vivo a ex vivo přístupem a výběru bezpečného vektoru (AAV, retroviry, nevirové nosiče).
·Zhodnoťte potenciál kmenových buněk a indukovaných pluripotentních buněk (iPSC) v moderní biomedicíně a regenerativní terapii.
·Seřaďte sekvenační metody podle vývoje a vysvětlete rozdíly mezi první, druhou a třetí generací sekvenačních technik.
·Navrhněte design experimentu pro kvantitativní analýzu genové exprese pomocí qRT-PCR, včetně výběru sond a normalizačních genů.
·Interpretujte data z transkriptomických analýz (RNA-Seq, DNA čipy) a vysvětlete princip prezentace dat pomocí teplotních map, clusterování a GO term analýzy.
·Vysvětlete strategie pro separaci a purifikaci proteinů s využitím různých typů chromatografie a afinitních tagů.
·Porovnejte použití analytických imunochemických metod (Western blot, ELISA) pro detekci a specifických proteinů ve vzorku a pro ověření protein-proteinových interakcí.
·Porovnejte výhody a limity konfokální mikroskopie oproti klasické fluorescenční mikroskopii a uveďte příklady a principy speciálních mikroskopických technik a definujte oblasti jejich použití a výhody oproti klasické mikroskopii.
·Vysvětlete základní pojmy a principy z oblasti fluorescence včetně fluorescenčních proteinů a uveďte příklady použití pro konkrétních aplikace.
·Analyzujte data z průtokové cytometrie, proveďte "gateování" populací a vysvětlete princip třídění buněk (cell sorting).
Poslední úprava: Čáp Michal, RNDr., Ph.D. (08.01.2026)
