Poslední úprava: RNDr. Petra Lišková, Ph.D. (20.08.2021)
Praktikum fluorescenční spektroskopie s biologickými a biochemickými aplikacemi. Zahrnuje úvod do fluorescenčních metod, úvody k jednotlivým úlohám a jejich praktické provedení v oblastech: měření spekter, zhášení fluorescence, polarizovaná fluorescence, FRET, fluorescence proteinů, dynamika biologických membrán, měření fyziologických charakteristik živých buněk. Časově rozlišená fluorescence. Analýza mikroskopického obrazu.
Poslední úprava: doc. RNDr. Radovan Fišer, Ph.D. (08.10.2020)
If possible, a full-time exercise will take place in 2020/2021. In case of a change to the online version, the enrolled students will be informed in time.
Laboratory course in fluorescence spectroscopy with biological and biochemical applications. The course covers introductory lecture about fluorescence methods and introductions into individual practical works covering: spectra measurements, fluorescence quenching, polarized fluorescence, FRET, fluorescence of proteins, dynamics of biological membranes, physiological characteristics of cells measured by fluorescence techniques, digital image processing.
Cíl předmětu
Poslední úprava: KONOP (19.04.2007)
Cílem praktického cvičení je seznámit s fluorescencí jako všestrannou metodou použitelnou v biologii. Studenti při samostatné práci s fluorometrem zvládnou základní techniky včetně vyhodnocení výsledků a návrhu experimentů.
Literatura -
Poslední úprava: doc. RNDr. Radovan Fišer, Ph.D. (19.03.2019)
Součástí kurzu je úvodní přednáška, prezentace je dostupná pro účastníky kurzu prostřednictvím "moodlu".
Joseph R. Lakowicz (2006): Principles of Fluorescence Spectroscopy , 3rd edition, Springer
Poslední úprava: doc. RNDr. Radovan Fišer, Ph.D. (24.10.2019)
The course includes an introductory lecture, presentation is available for course participants through Moodle.
Joseph R. Lakowicz (2006): Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd edition, Springer
Požadavky ke zkoušce -
Poslední úprava: RNDr. Petra Lišková, Ph.D. (20.08.2021)
K zápočtu je nutná přítomnost na úvodní přednášce, absolvování vstupního testu na e-learningové platformě Moodle http://dl2.cuni.cz/course/view.php?id=242 s minimálně 60% úspěšností.
Pro zpracování výsledků během kurzu je nezbytný vlastní notebook (Wi-Fi)!
Dále je nutné odevzdat kompletní protokoly v excelovském souboru. Excelovský soubor musí být uploadován jako úkol v Moodle k datu, které je určeno vždy na konci cvičení.
Poslední úprava: doc. RNDr. Radovan Fišer, Ph.D. (24.10.2019)
To gain the credits, one must be present at the introductory lecture, pass the entrance test operated through the e-learning platform Moodle http://dl2.cuni.cz/course/view.php?id=242 (with minimal success rate 60%).
It is also necessary to hand over complete reports in Excel file. Excel file must be uploaded as a task in Moodle to the date determined at the end of the course.
Sylabus -
Poslední úprava: RNDr. Petra Lišková, Ph.D. (18.08.2015)
1. Teoretická část - přednáška:
Úvod do fluorescenční spektroskopie. Jablonského diagram, emisní spektra a jejich změny, doba života excitovaného stavu, fluorescenční sondy a informace o nich, zhášení fluorescence a jeho typy, FRET, polarizovaná fluorescence, časově rozlišená fluorescence, spektrofluorimetry.
2. Praktická část - úlohy:
a) Kalibrace fluorometru, excitační a emisní spektra používaných sond, intenzita, spektra a polarita prostředí, vliv pH na spektra. Artefakty (vnitřní filtr, pozadí, korekce spekter, Ramanův rozptyl). Navržení optimálních podmínek pro pokus "v kyvetě" a pro pokus s konfokálním mikroskopu.
b) Trp a Tyr jako přirozené fluorofory. Spektra Trp v proteinech, jejich změny při oligomerizaci a při zabudování do biologické membrány.
c) Polarizovaná fluorescence. Anizotropie fluorescence, membránová fluidita, teplota a fázové přechody v syntetických lipidech a biologických membránách, fluidizace biologických membrán (artefakty: rozptyl a polarizace, korekce dat u složitějších biologických vzorků).
d) Měření časově rozlišené fluorescence: stanovení koncentrace iontů Cl- (zhášení).
e) Vyhodnocení dat z konfokálního mikroskopu: výpočet GP Laurdanu (fluidita buněčných mebrán); poměrové měření fluorescence a změny koncentrace vápníku v buňkách.
Poslední úprava: doc. RNDr. Radovan Fišer, Ph.D. (24.10.2019)
Introductory lecture, entrance test, introductions to individual practical tasks, independent measurements on fluorometer, evaluation of experimental data, preparation of protocols.
1. Introductory lecture:
Introduction to fluorescence spectroscopy, Jablonski diagram, absorption, emission spectra, its variations, fluorescence lifetime, probes, fluorescence quenching, FRET, polarization of fluorescence, time-resolved fluorescence, spectroscopic tools and fluorometers.
2. Practical tasks:
a) Fluorometer calibration, excitation and emission spectra, fluorescence intensity, polarity of environment. Artifacts (inner filter effect, background correction, Raman scattering). Design of experiments and data evaluation.
b) Tryptophan and tyrosine as intrinsic fluorophores, their emission spectra alone and in proteins, spectral shift.
c) Polarized fluorescence, fluorescence anisotropy, membrane fluidity and phase transition.
d) Time-resolved measurement: determination of concentration of Cl- ions (quenching).
e) Evaluation of the data from the confocal microscope: GP of Laurdanu (membrane fluidity); ratiometric fluorescence measurements (changes in calcium concentration in the cells).
Poslední úprava: RNDr. Petra Lišková, Ph.D. (20.08.2021)
Kurzu předchází přednáška a vstupní test. Vhodné je absolutorium kurzu biochemie. Nezbytná je dobrá znalost práce s programem MS Excel, Gnumeric nebo OpenOffice Calc.
Pro zpracování výsledků během kurzu je nezbytný vlastní notebook (Wi-Fi)!
Poslední úprava: doc. RNDr. Radovan Fišer, Ph.D. (24.10.2019)
The course precedes the lecture. To be familiar with therms of biochemistry is highly recommended. It is necessary to have skills to work with either MS Excel or Gnumeric or OpenOffice Calc or other.
For the processing of the results during the course and for passing the course, own laptop capable of wireless connection (Wifi) is required.
