Praktikum fluorescenční spektroskopie s biologickými a biochemickými aplikacemi. Zahrnuje úvod do fluorescenčních metod, úvody k jednotlivým úlohám a jejich praktické provedení v oblastech: měření spekter, zhášení fluorescence, polarizovaná fluorescence, FRET, fluorescence proteinů, dynamika biologických membrán, měření fyziologických charakteristik živých buněk. Časově rozlišená fluorescence. Analýza mikroskopického obrazu.
Poslední úprava: Lišková Petra, RNDr., Ph.D. (27.09.2024)
Laboratory course in fluorescence spectroscopy with biological and biochemical applications. The course covers introductory lecture about fluorescence methods and introductions into individual practical works covering: spectra measurements, fluorescence quenching, polarized fluorescence, FRET, fluorescence of proteins, dynamics of biological membranes, physiological characteristics of cells measured by fluorescence techniques, digital image processing.
Poslední úprava: Lišková Petra, RNDr., Ph.D. (27.09.2024)
Literatura -
Součástí kurzu je úvodní přednáška, prezentace je dostupná pro účastníky kurzu prostřednictvím "moodlu".
Joseph R. Lakowicz (2006): Principles of Fluorescence Spectroscopy , 3rd edition, Springer
Poslední úprava: Lišková Petra, RNDr., Ph.D. (27.09.2024)
The course includes an introductory lecture, presentation is available for course participants through Moodle.
Joseph R. Lakowicz (2006): Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd edition, Springer
Poslední úprava: Fišer Radovan, doc. RNDr., Ph.D. (24.10.2019)
Požadavky ke zkoušce -
K zápočtu je nutná přítomnost na úvodní přednášce, absolvování vstupního testu na e-learningové platformě Moodle http://dl2.cuni.cz/course/view.php?id=242 s minimálně 60% úspěšností.
Pro zpracování výsledků během kurzu je nezbytný vlastní notebook (Wi-Fi)!
Dále je nutné odevzdat kompletní protokoly v excelovském souboru. Excelovský soubor musí být uploadován jako úkol v Moodle k datu, které je určeno vždy na konci cvičení.
Poslední úprava: Lišková Petra, RNDr., Ph.D. (27.09.2024)
To gain the credits, one must be present at the introductory lecture, pass the entrance test operated through the e-learning platform Moodle http://dl2.cuni.cz/course/view.php?id=242 (with minimal success rate 60%).
It is also necessary to hand over complete reports in Excel file. Excel file must be uploaded as a task in Moodle to the date determined at the end of the course.
Poslední úprava: Fišer Radovan, doc. RNDr., Ph.D. (24.10.2019)
Sylabus -
1. Teoretická část - přednáška:
Úvod do fluorescenční spektroskopie. Jablonského diagram, emisní spektra a jejich změny, doba života excitovaného stavu, fluorescenční sondy a informace o nich, zhášení fluorescence a jeho typy, FRET, polarizovaná fluorescence, časově rozlišená fluorescence, spektrofluorimetry.
2. Praktická část - úlohy:
a) Kalibrace fluorometru, excitační a emisní spektra používaných sond, intenzita, spektra a polarita prostředí, vliv pH na spektra. Artefakty (vnitřní filtr, pozadí, korekce spekter, Ramanův rozptyl). Navržení optimálních podmínek pro pokus "v kyvetě" a pro pokus s konfokálním mikroskopu.
b) Trp a Tyr jako přirozené fluorofory. Spektra Trp v proteinech, jejich změny při oligomerizaci a při zabudování do biologické membrány.
c) Polarizovaná fluorescence. Anizotropie fluorescence, membránová fluidita, teplota a fázové přechody v syntetických lipidech a biologických membránách, fluidizace biologických membrán (artefakty: rozptyl a polarizace, korekce dat u složitějších biologických vzorků).
d) Měření časově rozlišené fluorescence: stanovení koncentrace iontů Cl- (zhášení).
e) Vyhodnocení dat z konfokálního mikroskopu: výpočet GP Laurdanu (fluidita buněčných mebrán); poměrové měření fluorescence a změny koncentrace vápníku v buňkách.
Poslední úprava: Lišková Petra, RNDr., Ph.D. (27.09.2024)
Introductory lecture, entrance test, introductions to individual practical tasks, independent measurements on fluorometer, evaluation of experimental data, preparation of protocols.
1. Introductory lecture:
Introduction to fluorescence spectroscopy, Jablonski diagram, absorption, emission spectra, its variations, fluorescence lifetime, probes, fluorescence quenching, FRET, polarization of fluorescence, time-resolved fluorescence, spectroscopic tools and fluorometers.
2. Practical tasks:
a) Fluorometer calibration, excitation and emission spectra, fluorescence intensity, polarity of environment. Artifacts (inner filter effect, background correction, Raman scattering). Design of experiments and data evaluation.
b) Tryptophan and tyrosine as intrinsic fluorophores, their emission spectra alone and in proteins, spectral shift.
c) Polarized fluorescence, fluorescence anisotropy, membrane fluidity and phase transition.
d) Time-resolved measurement: determination of concentration of Cl- ions (quenching).
e) Evaluation of the data from the confocal microscope: GP of Laurdanu (membrane fluidity); ratiometric fluorescence measurements (changes in calcium concentration in the cells).
Poslední úprava: Fišer Radovan, doc. RNDr., Ph.D. (24.10.2019)
Výsledky učení -
Úspěšný absolvent předmětu Fluorescenční spektroskopie v biologii:
popisuje základní fyzikální principy fluorescence, vysvětluje Jablonského diagram a vztah mezi excitačními a emisními spektry
vysvětluje pojem doby života excitovaného stavu a její souvislost s kvantovým výtěžkem a zhášecími procesy
rozlišuje typy zhášení fluorescence (statické, dynamické, samo-zhášení aj.) a objasňuje jejich vliv na měřenou intenzitu a dobu života
vysvětluje princip FRET, podmínky pro jeho výskyt a informace o vzdálenostech a interakcích v biomolekulárních systémech, které lze z detekce FRETu odvodit
popisuje princip polarizované fluorescence a anizotropie a jejich vztah k molekulární rotaci a mikroviskozitě prostředí
vysvětluje princip časově rozlišené fluorescence a rozdíl mezi měřením v ustáleném stavu a v pulzním módu
měří excitační a emisní spektra fluorescenčních sond a přirozených fluoroforů (Trp, Tyr) a interpretuje změny spekter v závislosti na prostředí (pH, polarita, vazba na bílkoviny či membrány)
provádí běžné fluorescenční pokusy „v kyvetě”, navrhuje základní experimenty na konfokálním mikroskopu s ohledem na optimalizaci signálu a minimalizaci artefaktů
rozpoznává a kriticky hodnotí nejčastější artefakty fluorescenčních měření (vnitřní filtr, Ramanův rozptyl, autofluorescence pozadí, rozptyl světla a polarizační artefakty) a navrhuje vhodné korekce
analyzuje experimentální data časově rozlišené fluorescence, určuje relevantní parametry (doby života, amplitudy komponent) a posuzuje kvalitu proloženého modelu (fitu)
popisuje konstrukci a funkci základních typů spektrofluorimetrů a konfokálních mikroskopů využívaných ve fluorescenční spektroskopii
kriticky hodnotí přesnost a reprodukovatelnost vlastních měření, identifikuje zdroje chyb a navrhuje jejich minimalizaci
posuzuje vhodnost vybraných fluorescenčních metod a sond pro řešení konkrétního biologického problému a zdůvodňuje své volby na základě teoretických i praktických znalostí
interpretuje výsledky v kontextu současné literatury a dokáže formulovat omezení a možné alternativní interpretace dat
pracuje bezpečně v laboratorním prostředí, dodržuje zásady práce s laserovými a UV zdroji, biologickým materiálem a chemickými látkami
efektivně komunikuje výsledky experimentů písemnou (protokoly, krátké zprávy) i ústní formou (prezentace), včetně jasného popisu metod, analýzy chyb a závěrů
Poslední úprava: Fišer Radovan, doc. RNDr., Ph.D. (16.01.2026)
A successful graduate of the course Fluorescence Spectroscopy in Biology:
- describes the basic physical principles of fluorescence, explains the Jablonski diagram and the relationship between excitation and emission spectra
- explains the concept of the lifetime of the excited state and its connection with the quantum yield and quenching processes
- distinguishes between the types of fluorescence quenching (static, dynamic, self-quenching, etc.) and explains their influence on the measured intensity and lifetime
- explains the principle of FRET, the conditions for its occurrence and information about distances and interactions in biomolecular systems that can be derived from FRET detection
- describes the principle of polarized fluorescence and anisotropy and their relationship to molecular rotation and microviscosity of the environment
- explains the principle of time-resolved fluorescence and the difference between steady-state and pulsed mode measurements
- measures the excitation and emission spectra of fluorescent probes and natural fluorophores (Trp, Tyr) and interprets changes in spectra depending on the environment (pH, polarity, binding to proteins or membranes)
- performs common fluorescence experiments "in a cuvette", designs basic experiments on a confocal microscope with regard to signal optimization and artifact minimization
- recognizes and critically evaluates the most common artifacts of fluorescence measurements (inner filter, Raman scattering, background autofluorescence, light scattering and polarization artifacts) and suggests appropriate corrections
- analyzes experimental data of time-resolved fluorescence, determines relevant parameters (lifetimes, component amplitudes) and assesses the quality of the fitted model
- describes the design and function of basic types of spectrofluorimeters and confocal microscopes used in fluorescence spectroscopy
- critically evaluates the accuracy and reproducibility of own measurements, identifies sources of errors and suggests their minimization
- assesses the suitability of selected fluorescence methods and probes for solving a specific biological problem and justifies their choices based on theoretical and practical knowledge
- interprets results in the context of current literature and is able to formulate limitations and possible alternative interpretations of data
- works safely in a laboratory environment, follows the principles of working with laser and UV sources, biological material and chemicals
- effectively communicates experimental results in written (protocols, short reports) and oral form (presentations), including a clear description of methods, error analysis and conclusions
Poslední úprava: Fišer Radovan, doc. RNDr., Ph.D. (06.02.2026)
Vstupní požadavky -
Kurzu předchází přednáška a vstupní test. Vhodné je absolutorium kurzu biochemie. Nezbytná je dobrá znalost práce s programem MS Excel, Gnumeric nebo OpenOffice Calc.
Pro zpracování výsledků během kurzu je nezbytný vlastní notebook (Wi-Fi)!
Poslední úprava: Lišková Petra, RNDr., Ph.D. (27.09.2024)
The course precedes the lecture. To be familiar with therms of biochemistry is highly recommended. It is necessary to have skills to work with either MS Excel or Gnumeric or OpenOffice Calc or other.
For the processing of the results during the course and for passing the course, own laptop capable of wireless connection (Wifi) is required.
Poslední úprava: Fišer Radovan, doc. RNDr., Ph.D. (24.10.2019)
