text size

Využití hmotnostně spektrometrických metod k tvorbě databáze biologických agens kompatibilní s evropským datovým systémem

Notice: I hereby declare that I am aware that the information acquired from theses published by Charles University may not be used for commercial purposes or may not be published for educational, scientific or other creative activities as activities of person other than the author.
Title:
Využití hmotnostně spektrometrických metod k tvorbě databáze biologických agens kompatibilní s evropským datovým systémem
Titile (in english):
Application of mass spectrometric methods to development of a biological agents database compatible with European datasystem
Type:
Rigorosum thesis
Author:
RNDr. Michal Dřevínek
Thesis Id:
139517
Faculty:
Faculty of Science (PřF)
Department:
Department of Analytical Chemistry (31-230)
Study programm:
Chemistry (N1407)
Study branch:
Analytical Chemistry (NANALD)
Degree granted:
RNDr.
Defence date:
23/09/2013
Defence result:
Pass
Language:
Czech
Abstract (in czech):
Předkládaná disertační práce je zaměřena na využití metody MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie pro identifikaci vysoce rizikových bakteriálních patogenů. V rámci disertační práce jsou řešeny celkem tři vědecké projekty. První část disertační práce je věnována nalezení optimálního protokolu přípravy vzorků k MALDI-TOF MS analýze vysoce virulentních bakterií. Na panelu 15 bakteriálních kmenů zahrnujících Gram-pozitivní i Gram-negativní druhy byla provedena srovnávací studie čtyř metod přípravy vzorků, kompatibilních s MALDI-TOF MS. V rámci studie byla porovnávána schopnost inaktivace vzorků bakteriálních kultur, výtěžnost bakteriálních proteinů a kvalita získaných hmotnostních spekter. Na základě výsledků bylo zjištěno, že nejvyššího výtěžku proteinů a optimální kvality spekter je dosaženo při použití metody založené na inaktivaci ethanolem v kombinaci s extrakcí kyselinou mravenčí a acetonitrilem. Druhý projekt byl zaměřen na tvorbu referenční databáze MALDI-TOF MS profilů vysoce rizikových patogenů. Za použití statistického zpracování změřených hmotnostních spekter byla vytvořena databáze, obsahující v současné době spektrální profily 392 kmenů 12 vysoce virulentních bakteriálních druhů. Databáze byla validována v mezinárodních srovnávacích testech, na základě výsledků validace byla metoda identifikace vysoce rizikových bakterií za použití vytvořené referenční databáze akreditována ČIA a část databáze byla komercializována. Pro účely evropské databáze typizačních znaků vybraných biologických agens byla provedena MALDI-TOF analýza vzorků kmenů F. tularensis, Brucella spp. a V. cholerae. Referenční databáze hmotnostních spekter pokrývající rod Legionella byla použita pro identifikaci obtížně určitelných klinických izolátů a diferenciaci sérologicky nerozlišitelných druhů. Použití databáze vedlo k identifikaci 9 nových druhů rodu Legionella, jejichž novost byla následně potvrzena sekvenačními analýzami mip genu. Ve třetím projektu, zaměřeném na diferenciaci blízce příbuzných druhů rodu Yersinia metodou MALDI-TOF MS, byla vytvořena databáze hmotnostních spekter 146 kmenů příslušejících všem 13 známým druhům tohoto rodu. Ve spektrech byly identifikovány rodově a druhově specifické markery umožňující odlišení blízce příbuzných druhů Y. pestis a Y. pseudotuberculosis. Použití MALDI-TOF MS/MS analýzy pak vedlo k určení původu SIPB Y. pestis, jímž je fragment aktivačního faktoru plazminogenu Pla.
Abstract:
This PhD thesis applies MALDI-TOF mass spectrometry to identification of highly pathogenic bacteria. Three major topics were studied in this thesis. The aim of the first project was to propose a universal workflow of sample preparation method for the identification of highly virulent pathogenes by MALDI-TOF MS. Fifteen bacterial species, including highly virulent Gram-positive and Gram-negative bacteria were employed in the comparative study of four sample preparation methods compatible with MALDI-TOF MS. Based on the values of protein yield and spectral quality, the method using combination of ethanol treatment followed by extraction with formic acid and acetonitrile shows the highest extraction efficacy and the spectral quality with no detrimental effect caused by storage. Thus, this can be considered as a universal sample preparation method for the identification of highly virulent microorganisms by MALDI-TOF mass spectrometry. In the second part, a reference database of MALDI-TOF MS profiles of high risk pathogens, containing mass spectra of 392 strains belonging to 12 bacterial species, was created. The database was validated in international proficiency tests. Based on the validation studies, the use of the database for identification of high risk pathogens was accredited by Czech Institute for Accreditation and a part of the database has been commecialized. For the purposes of European database of biological agents, a MALDI-TOF analysis of F. tularensis, Brucella spp. and V. cholerae was performed and the data included into the database. A reference database of Legionella genus was created and used for identification of Legionella species undistinguishable by serological methods. The use of the database revealed 9 new species belonging to Legionella genus; the novelty was confirmed by mip gene sequencing. The third project, focused on differentiation of closely related Yersinia species, a total of 146 strains of different Yersinia species and 35 strains of other relevant genera of the Enterobacteriaceae family have been studied using MALDI-TOF MS and chemometrics. The mass spectral profiles were subsequently analyzed by statistical methods to reveal specifically identifying biomarker proteins (SIBP). Bioinformatic approaches and tandem mass spectrometry were employed to reveal the molecular identity of biomarker ions. For example, the Y. pestis-specific biomarker at m/z 3065 could be identified as a fragment of the plasmid-encoded plasminogen activator (Pla), which is one of the major virulence factors in plague infections.
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis RNDr. Michal Dřevínek 3.53 MB
Download Abstract in czech RNDr. Michal Dřevínek 20 kB
Download Abstract in english RNDr. Michal Dřevínek 9 kB
Download Defence's report doc. RNDr. Ivan Jelínek, CSc. 78 kB