Poslední úprava: RNDr. Daniel Kavan, Ph.D. (28.09.2021)
Studenti se seznámí se základními biochemickými metodami používanými při izolaci proteinů a nukleových kyselin. Provádí extrakci proteinů z přírodních materiálů, centrifugaci, vysolování, dialýzu, lyofilizaci. Další metodou, která má široké uplatnění v biochemii, je gelová chromatografie, studenti separují protein ze směsi nebo stanoví relativní molekulovou hmotnost neznámého proteinu. Separace proteinů a stanovení relativní molekulové hmotnosti se provádí rovněž elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS. Velká pozornost je věnována zásadám práce s enzymy: stanovení specifické aktivity enzymu, zjištění afinity enzymu k substrátu, stanovení maximální rychlosti reakce, pH optima, sledování časového průběhu reakce a vliv inhibitorů a aktivátorů na enzymovou reakci. Přítomnost izoenzymů je demonstrována na příkladu laktátdehydrogenasy, kterou studenti separují v polyakrylamidovém gelu za nativních podmínek a detekují enzymovou aktivitu v gelu. Součástí praktika jsou ústní závěrečné prezentace a diskuse týkající se dosažených výsledků.
Poslední úprava: RNDr. Jana Rubešová, Ph.D. (26.02.2018)
Practical course in biochemistry is provided by Helena Ryšlavá, Daniel Kavan, Veronika Hýsková, Petr Novák, Petr Pompach, Josef Chmelík, Renata Ptáčková, Michal Rosůlek, Lukáš Slavata, Petra Darebná a Kateřina Bělonožníková
The students are dealing with basic biochemical methods used for protein and nucleic acid isolation and their characterization (extraction, centrifugation, precipitation, dialysis, protein content determination). Gel filtration is used for protein purification from a mixture or for relative molecular mass determination. The students determine the relative molecular mass of proteins by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Important part of the practical course is dealing with enzymes, determination of Michaelis constant, maximal reaction rate, pH optimum, activation and inhibition, electrophoretic separation of isoenzymes and their detection in gel.
Literatura
Poslední úprava: prof. RNDr. Jan Kotek, Ph.D. (20.03.2018)
Laboratorní cvičení z biochemie, editoři: M. Kodíček, O. Valentová; Praha 2000
Požadavky ke zkoušce
Poslední úprava: RNDr. Daniel Kavan, Ph.D. (11.01.2023)
- práce na úloze bude umožněna jen studentům, kteří prokážou dostatečné porozumění principům - před odchodem je nutné nahlásit získané výsledky - protokol ve formátu pdf (případně vytištěný) odevzdat nejpozdeji do týdne, jinak úloha propadá - v případě oprav musí být protokol bez vad schválen do tří týdnů od vypracování úlohy - k zápočtovému testu může scházet nejvýše jeden protokol - pro získání zápočtu je třeba absolvovat prezentaci vybrané úlohy splnit podmínky závěrečného testu odevzdat protokoly ke všem úlohám vrátit klíč od skříňky na chodbě
Sylabus -
Poslední úprava: RNDr. Daniel Kavan, Ph.D. (28.09.2021)
Studenti vypracují vždy jednu úlohu z následujících okruhů úloh: 1. Izolace proteinu s enzymovou aktivitou a stanovení specifické aktivity. 2. Gelová chromatografie. 3. Separace proteinů elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v prostředí SDS a stanovení relativní molekulové hmotnosti těchto proteinů. 4. Sledování afinity enzymu k substrátu - určení Michaelisovy konstanty a maximální rychlosti reakce. (5. Určení pH optima, sledování vlivu inhibitorů a aktivátorů na aktivitu enzymu, časový průběh enzymové reakce, detekce enzymové aktivity v polyakrylamidovém gelu.) (6. Práce s DNA: Hledání pachatele trestného činu.) 7. Ústní prezentace teorie a výsledků jedné úlohy.
Pro úspěšnou práci v praktiku je nezbytné ovládat software používaný k vyhodnocování výsledků (tabulkový procesor - výpočty se vzorci, sestavení správného typu grafu, chybové úsečky; grafický program - ořez a projasnění fotografií; matematický program - provedení nelineární regrese). K dispozici jsou vzorové protokoly, které slouží jednak jako vzor odevzdávaných výsledků a jednak si podle nich studenti mohou předem vyzkoušet vyhodnocování dat.
Poslední úprava: RNDr. Jana Rubešová, Ph.D. (26.02.2018)
1. Isolation of a protein - enzyme, determination of specific activity
2. Gel chromatography of proteins (separation, relative molecular mass determination)
3. SDS - polyacrylamide electrophoresis (determination of relative molecular mass of proteins)
4. Practical enzymology - kinetic characteristics, Michaelis constants, maximal reaction rate, pH optimum, activation and inhibition of enzymes, electrophoretic separation of isoenzymes and detection of the enzyme activity in gel
