Laboratory Methods: a Practical Course - MB160C84E

• Anglický název: Laboratory Methods: a Practical Course
• Český název: Laboratorní metody: cvičení
• Zajišťuje: Katedra parazitologie (31-161)
• Fakulta: Přírodovědecká fakulta
• Platnost: od 2023 do 2023
• Semestr: letní
• E-Kredity: 3
• Způsob provedení zkoušky: letní s.:
• Rozsah, examinace: letní s.:0/3, Z [HT]
• Počet míst: 12
• Minimální obsazenost: 5
• 4EU+: ne
• Virtuální mobilita / počet míst pro virtuální mobilitu: ne
• Stav předmětu: vyučován
• Jazyk výuky: angličtina
• Garant: Mgr. Roman Leontovyč, Ph.D.
• Vyučující: Mgr. Roman Leontovyč, Ph.D.

Anotace

čeština

Poslední úprava: Mgr. Roman Leontovyč, Ph.D. (18.03.2019)

Praktikum má za cíl seznámit studenty se základy práce v laboratoři, dále pak se základními parazitologickým technikami zaměřenými na práci s kulturami prvoků a diagnostiku prvoků a helmintů. Obecnější část praktik je zaměřena na molekulární a biochemické metody s mezioborovým využitím, kde je kladen důraz na pochopení základních principů metod.

angličtina

Poslední úprava: Mgr. Roman Leontovyč, Ph.D. (18.03.2019)

The aim of the course is to introduce students to basic laboratory practice. Students will be acquainted with basic microbiological and parasitological techniques focused on handling the protozoan cultures and diagnostics of protozoan and helminth parasites. General part of the course is focused on molecular and biochemical methods, where understanding of fundamentals of the methods is emphasized.

Literatura

čeština

Poslední úprava: RNDr. Helena Kulíková (18.03.2019)

Povinná literatura:Vytištěné postupy k praktickým úlohám, se stručným úvodním popisem jednotlivých metod. Prezentace.
Doporučená literatura: D. Thienpont, F. Rochette, O. F. J. Vanparijs. Diagnosing helminthiasis by coprological examination. 2nd ed. Beerse, Belgium: Janssen Research Foundation 1986. ISBN BWB30960491
Technical guide for ELISA available at https://www.seracare.com/globalassets/seracare-resources/tg-protocols-and-troubleshooting.pdf
T.A. Brown. Essential Molecular BiologyVolume 1. 2nd ed. Oxford, UK: Oxford University Press, 2000. ISBN 0-19-963643
John M. S. Bartlett, David Stirling. Methods in Molecular Biology, vol. 226 PCR Protocols.2nd ed. Totowa, New Jersey: Humana Press, 2003. ISBN 0-89603-642-1
Brenda D. Spangler. Methods in molecular biology and protein chemistry – Cloning and characterization of an enterotoxin subunit. West Sussex, UK: John Wiley & Sons, Ltd., 2002. ISBN 0-470-84360-8
Daniel M. Bollag, Stuart J. Edelstein. Protein methods New York, NY: Wiley-Liss, 1991. ISBN 0-471-56871-6

angličtina

Poslední úprava: Mgr. Roman Leontovyč, Ph.D. (18.03.2019)

Mandatory: Printed tutorials for practical tasks, with a brief overview of the methods. Presentations

 

Recommended:

D. Thienpont, F. Rochette, O. F. J. Vanparijs. Diagnosing helminthiasis by coprological examination. 2nd ed. Beerse, Belgium: Janssen Research Foundation 1986. ISBN BWB30960491

 

Technical guide for ELISA

available at https://www.seracare.com/globalassets/seracare-resources/tg-protocols-and-troubleshooting.pdf

 

T.A. Brown. Essential Molecular BiologyVolume 1. 2nd ed. Oxford, UK: Oxford University Press, 2000. ISBN 0-19-963643

 

John M. S. Bartlett, David Stirling. Methods in Molecular Biology, vol. 226 PCR Protocols.2nd ed. Totowa, New Jersey: Humana Press, 2003. ISBN 0-89603-642-1

 

Brenda D. Spangler. Methods in molecular biology and protein chemistry – Cloning and characterization of an enterotoxin subunit. West Sussex, UK: John Wiley & Sons, Ltd., 2002. ISBN 0-470-84360-8

 

Daniel M. Bollag, Stuart J. Edelstein. Protein methods New York, NY: Wiley-Liss, 1991. ISBN 0-471-56871-6

Požadavky ke zkoušce

čeština

Poslední úprava: Mgr. Roman Leontovyč, Ph.D. (18.03.2019)

Pro udělení zápočtu je vyžadována aktivní účast na praktiku (povolena je 1 omluvená absence). Před vybranými praktiky proběhne písemný test zaměřený na probíranou látku, výsledky průběžných testů jsou zohledněny v závěrečném testu. Testy jsou psané formou „multiple-answer“ (nula až všechny možnosti), s částí zaměřenou na krátké slovní odpovědi. Při nejednoznačném výsledku písemného testu následuje ústní přezkoušení.

angličtina

Poslední úprava: Mgr. Roman Leontovyč, Ph.D. (18.03.2019)

Active participation in the course is mandatory (one excused absence is allowed). The short test will be written before the selected lessons focused on the topic of the lesson. The results of the continuous tests will be taken into account in the final test. All tests will be in the written form where “multiple-answer” testing (none to all answers correct) will be applied, followed by short-answer questions. Ambiguous results can lead to the oral part of the exam.

Sylabus

čeština

Poslední úprava: Mgr. Roman Leontovyč, Ph.D. (18.03.2019)

1. Základy laboratorní práce

Teoretická část:

-      bezpečnost, vážení/měření, zásady správného pipetování, představení základního laboratorního vybavení (centrifugy – vyvážení, RPM/g, flowbox, atd.), zásady sterilní práce

Praktická část:

-      výpočty: převody jednotek, objemová koncentrace, molární koncentrace

-      příprava roztoků – ředění, úprava a měření pH

-      příprava růstových médií a ploten

 

2. Technika a barvení suchých nátěrů, manipulace s laboratorní myší

Teoretická část:

-      parazitičtí prvoci přenášení hmyzem; použití laboratorních zvířat v parazitologii a mikrobiologii

Praktická část:

-      krevní roztěr infekcí Trypanosoma brucei, Plasmodium berghei

-      tlustá kapka - diagnostika Plasmodium berghei

-      barvení suchých nátěrů metodou Giemsy-Romanowského, rychlé barvení Dade Diff-Quik

-      manipulace s laboratorní myší, nácvik IP inokulace 

 

3. Klonování, kvantitativní práce s prvoky 

Teoretická část:

-      růst mikrobiálních kultur; růstová křivka, výpočet generační doby; metody klonování, colony-forming efficiency

Praktická část:

-      práce s Burkerovou počítací komůrkou

-      výpočet množství buněk 

-      manipulace s tekutými médii, nácvik pasážování kultur

-      izolace klonů metodou mezního ředění (Trichomonas vaginalis)

 

4. Kultivační techniky

Teoretická část:

-      typy mikrobiálních kultur; složky kultivačních médií; postupy při kryoprezervaci prvoků

Praktická část:

-      vyhodnocení klonovacího  pokusu

-      axenizace prvoků, výroba migrační rourky

-      zmražovací techniky, kryoprezervace prvoků, demonstrace kryobanky

 

5. Koprologie

Teoretická část:

-      zásady sběru materiálu, hygiena, pomůcky, kalibrace okuláru, přehled metod

Praktická část:

-      koprologické vyšetření pomocí flotace, sedimentace, larvoskopie 

 

6. ELISA

Teoretická část:

-      princip, využití v diagnostice

Praktická část:

-      test na přítomnost protilátek proti Toxoplasma gondii

 

7. Nukleové kyseliny I

Teoretická část:

-      struktura DNA (párování bazí), princip izolace DNA pomocí silikátové kolony, princip izolace DNA/RNA pomocí TRIzol Reagent, kontrola integrity RNA

 

Praktická část:

-      izolace DNA – silikátové kolony

-      precipitace DNA

-      stanovení koncentrace DNA

 

8. Nukleové kyseliny II

Teoretická část:

-      princip PCR, modulace PCR (nested PCR, RT-PCR, q-PCR, multiplex PCR), princip Sangerovy sekvenace

Praktická část:

-      příprava reakce PCR, nastavení thermo cycleru

-      gelová elektroforéza

-      extrakce DNA z gelu

 

9. Rekombinantní proteiny I

Teoretická část:

-      princip exprese cizorodého proteinu v bakteríální buňce, princip proteinové elektroforézy SDS PAGE

Praktická část:

-      kryoprezervace bakterií

-      elektroforetické stanovení proteinového profilu bakteriální kolonie pomocí – SDS PAGE (test solubility proteinu)

 

10. Rekombinantní proteiny II

Teoretická část:

-      izolace rekombinantního proteinu za nativních a denaturujících podmínek, princip izolace proteinu značeného histidinovou kotvou 

Praktická část:

-      izolace rekombinantního proteinu pomocí afinitní chromatografie (His-Tag)

-      stanovení koncentrace rekombinantního proteinu

 

11.  Hmotnostní spektrometrie, imunoblot 

Teoretická část:

-      využití hmotnostní spektrometrie při analýze biologických vzorků (diagnostika, identifikace rekombinantních proteinů, analýza proteomu), příprava vzorku na analýzu

-      imunoblot – diagnostické využití, identifikace rekombinantních proteinů 

Praktická část:

-      imunoblot – identifikace proteinu značeného histidinovou kotvou

angličtina

Poslední úprava: Mgr. Roman Leontovyč, Ph.D. (18.03.2019)

1.  Fundamentals of the laboratory work

 

Theoretical part:

-      safety, weights & measures, the fundamentals of pipette handling, introduction of the basic laboratory equipment (centrifuges – balance, RPM/g, flowbox.), sterile work.

Practical part:

-       calculations: unit conversions, volume concentration, molar concentration

-      preparation of the solutions – dilution, pH adjustment and measurement

-      preparation of the growth media and agar plates

 

2. Dry smear preparation and staining, handling the laboratory mouse

Theoretical part:

-       parasitic protozoa transmitted by insects; laboratory animals in parasitology and microbiology

Practical part:

-      blood smear infections of  Trypanosoma brucei, Plasmodium berghei

-      thick drop – diagnostics of Plasmodium berghei

-      dry smears -  Giemsa-Romanowsky staining, Dade Diff-Quik staining

-      handling of the laboratory mouse, IP inoculation

 

3. Cloning, quantitative experiments with protozoa

Theoretical part:

-       growth of the microbial cultures, growth curve, calculation of the generation time; cloning methods, colony-forming efficiency

Practical part:

-       usage of the Burker counting chamber

-       cell counting

-       handling the liquid media, maintaining cells in culture 

-      cloning by limiting dilution (Trichomonas vaginalis)

 

 

 

4. Cultivation techniques

Theoretical part:

-       types of microbial cultures, cultivation media, procedures in cryopreservation of the protozoa 

Practical part:

-       evaluation of the cloning experiment

-       axenization of the protozoan cultures, making of the migration tube 

-       cryopreservation techniques, cryopreservation of the protozoa, cryobank demonstration

 

5. Coprological methods

Theoretical part:

-       principles of material collection, hygienic measures, requirements, ocular micrometre calibration, methods overview

Practical part:

-       coprological examination using flotation, sedimentation, larvoscopy

 

6. ELISA

Theoretical part:

-       principle, usage in diagnostics

Practical part:

-      antibody detection against the Toxoplasma gondii

 

7. Nucleic acids I

Theoretical part:

-       DNA structure (base pairing), principle of DNA isolation on silicate, principle of isolation of DNA/RNA using TRIzol Reagent, RNA integrity control 

Practical part:

-      DNA isolation – silicate columns

-      DNA precipitation

-      determination of DNA concentration

 

8. Nucleic acids II

Theoretical part:

-       PCR principle, PCR modulations (nested PCR, RT-PCR, q-PCR, multiplex PCR)

Practical part:

-      PCR reaction preparation, operating the thermocycler

-      agarose gel electrophoresis

-      DNA purification from an agarose gel

 

9.  Rcombinant proteins I

Theoretical part:

-       principle of the expression of foreign protein in bacterial cell, principle of the protein electrophoresis SDS PAGE

Practical part:

-      cryopreservation of the bacterial cultures

-      assessment of the protein profile of the bacterial colony using of SDS PAGE (protein solubility test)

 

10.  Rcombinant proteins II

Theoretical part:

-       isolation of the recombinant protein in native and denaturing conditions, principle of the isolation of the polyhistidine tagged protein

Practical part:

-      isolation of the recombinant protein using affinity chromatography (His-Tag)

 

11. Mass spectrometry, immunoblot

Theoretical part:

-       mass spectrometry analysis of biological samples (diagnostics, recombinant proteins identification, proteome analysis), sample preparation

Practical part:

-      immunoblot – identification of His-tagged protein