Fluorescenční mikroskopie v buněčné biologii - MB151P96

• Anglický název: Fluorescence microscopy in cell biology
• Český název: Fluorescenční mikroskopie v buněčné biologii
• Zajišťuje: Katedra buněčné biologie (31-151)
• Fakulta: Přírodovědecká fakulta
• Platnost: od 2023
• Semestr: zimní
• E-Kredity: 3
• Způsob provedení zkoušky: zimní s.:
• Rozsah, examinace: zimní s.:2/0, Zk [HT]
• Počet míst: 20
• Minimální obsazenost: neomezen
• 4EU+: ne
• Virtuální mobilita / počet míst pro virtuální mobilitu: ne
• Stav předmětu: vyučován
• Jazyk výuky: čeština
• Poznámka: povolen pro zápis po webu
• Garant: doc. RNDr. Jan Malínský, Ph.D.
• Vyučující: doc. RNDr. Jan Malínský, Ph.D.

Anotace

Poslední úprava: doc. RNDr. Jan Malínský, Ph.D. (04.09.2023)

Přednáška podává přehled fluorescenčně mikroskopických technik používaných v moderní buněčné biologii. Výklad vychází ze základních znalostí středoškolské fyziky a chemie a je zaměřen na praktické využití získaných znalostí. Postupuje od objasnění základních principů mikroskopického zobrazení, přes nezbytné minimum technických detailů umožňující porozumění tvorbě mikroskopického obrazu, až ke konkrétním metodám vizualizace biomolekul a biochemických/fyziologických procesů v buňce. Důraz je kladen na možné zdroje artefaktů a možnosti jejich eliminace. Předmět je určen studentům biologických oborů magisterského a doktorského studia.

Cíl předmětu

Poslední úprava: doc. RNDr. Jan Malínský, Ph.D. (08.09.2011)

Absoventi získají informovaný přehled o nejužívanějších technikách moderní fluorescenční mikroskopie a budou schopni účelně použít fluorescenční mikroskop pro buněčně biologická pozorování. Absolvent by měl být schopen samostatně rozhodnout, jaký přístup použije pro pozorování konkrétního preparátu, jaké informace je možno ze získaných dat vyčíst, a dokáže tyto interpretovat s vědomím hlavních zdrojů možných chyb.

Literatura

Poslední úprava: doc. RNDr. Jan Malínský, Ph.D. (11.04.2012)

Sluder G and Wolf DE (Eds.) Digital microscopy, 3rd Edition. Methods in Cell Biology 81 (2007) ISBN 978-0-12-374025-0

Sullivan KF (Ed.) Fluorescent proteins. Methods in Cell Biology 85 (2008) ISBN 978-0-12-372558-5

Lakowicz JR. Principles of fluorescence spectroscopy, 3rd Edition. Springer (2006) ISBN 978-0387-31278-1.

Web

http://www.olympusmicro.com

http://www.microscopyu.com

http://micro.magnet.fsu.edu

Požadavky ke zkoušce

Poslední úprava: doc. RNDr. Jan Malínský, Ph.D. (11.04.2012)

Před vlastní zkouškou student vypracuje esej v rozsahu 500-1000 slov v jazyce českém, slovenském nebo anglickém na téma, které se 1) vztahuje k přednesenému učivu a 2) neshoduje s tématem eseje zvoleného dříve jiným studentem. Esej

vypovídá o kvalitě přípravy na zkoušku. Nemá přímý vztah k otázkám kladeným při zkoušce, je však součástí hodnocení. Termín odevzdání eseje je nejpozději 2 týdny před termínem zkoušky.

Zkouška probíhá ústní formou v jazyce, ve kterém byl sepsán esej. Během zkoušky by student měl prokázat porozumění základním pojmům probraného tématu v přibližném rozsahu:

Mikroskopické zobrazení - Princip mikroskopického zobrazení; Zvětšení mikroskopu; Optické vady; Limity zobrazení mikroskopu (Airyho disk, Rayleighovo kritérium)

Práce s mikroskopem - Köhlerovo osvětlení a jak ho nastavit; Druhy objektivů; Imerze

Vybrané zobrazovací metody - Fázový kontrast; Diferenciální interferenční kontrast

Luminiscence - Fluorescence, fosforescence (fyzikální podstata, Jablonskiho diagram); Bioluminiscence; Tvar fluorescenčního spektra - solvatace, polarita prostředí, teplotní závislost

Fluorescenční mikroskop - Vlastnosti zobrazení; Výhody fluorescenční mikroskopie oproti zobrazení ve světlém poli

Konstrukce fluorescenčního mikroskopu - Zdroj světla (výbojky); Interferenční filtr; Detektor (CCD kamera); Zdroje šumu v obrazu z fluorescenčního mikroskopu

Princip a konstrukce konfokálního mikroskopu - Spinning-disk mikroskop; Laserový skenovací mikroskop;Výhody a nevýhody konfokálního oproti konvenčnímu zobrazení

Speciální optické prvky - Laser; AOTF; AOBS; Monochromátory (hranolový, mřížkový); Fotonásobič

Digitalizace obrazu - Pixel, voxel, kódování intenzity a barev, dynamická hloubka; Vzorkování: Nyquistův teorém

Poměr signál/šum - Zdroje šumu u CCD a PMT detekce, maximalizace SNR během snímání

Snímání obrazu: detekce nebo degradace? - Photobleaching; Maximální efektivní excitace, počet fluoroforů ve vzorku; Spektrální separace signálů: parazitní excitace, sekvenční snímání, linear unmixing

Měření intenzity fluorescence - Vztah intenzity fluorescence ke koncentraci fluoroforu; Limitace srovnávacích měření

Morfologická měření - Prahování; Zdroje artefaktů

Vzájemná lokalizace dvou signálů - Základní pojmy: kolokalizace, náhodný překryv, repulse; 2D-scatter plot (pixelogram); Korelace signálů - Pearsonův koeficient; Kroskorelační funkce

Biosensory - Permeabilita membrány, koncentrace iontů, pH, membránový potenciál

Tetracysteinové nekovalentní značky (FlAsH, ReAsH)

Fluoreskující proteiny - GFP a další barevné proteiny; Speciální proteiny: pHluorin, timery

Zásady zobrazování živých buněk

Měření redistribuce fluoroforu - Princip metody: FRAP, FLIP, fotoaktivace, fotokonverze; Speciální fluoreskující proteiny

FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) - Princip metody; Vyhodnocení dat: autokorelační funkce, srovnání s FRAP

Single particle tracking - Princip metody; Vyhodnocení dat: mean square displacement

FCCS (Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy) - Princip metody, kroskorelační funkce; Aplikace

FRET - Podstata jevu, pravděpodobnost FRET, aplikace; Metody měření (přímý FRET, vybělení akceptoru)

Časově rozlišená fluorescence - Dohasínání a doba života fluorescence; Metody měření časově rozlišené fluorescence (TD-FLIM, FD-FLIM); TCSPC, FLIM-FRET; Anizotropie fluorescence, Homo-FRET

BiFC - Princip metody, výhody a nevýhody; Mikroskopické zobrazení jako konvoluce; Konvoluce: definice a vlastnosti; Zobrazovací funkce mikroskopu - point spread function (PSF)

Dekonvoluce - Zadání (zrestaurovat zpětně podobu pozorovaného objektu); Způsoby řešení: přímá inverze, iterativní metody; Slepá dekonvoluce; Měření PSF; Možné artefakty dekonvoluční analýzy

STORM/FPALM/PALM - Princip metody; Limitace: příprava preparátu, doba snímání obrazu

Excitace fluorescence v malé části vzorku - Multifotonová excitace, TIRF, SPIM; Princip, možnosti, omezení; Kombinace s PALM, STORM

Strukturovaná iluminace - Princip SIM, SSIM, 3D-SIM; Tvar OTF

STED - Princip metody, CW-STED; Rozlišení; RESOLFT

Úprava kontrastu - lineární a nelineární úpravy kontrastu, zachování obrazové informace; LUT; princip a způsoby použití

Lineární filtrace - potlačení šumu, detekce lokálních extrémů a hran, zostření detailů

Filtry využívající Fourierovy transformace - dolní propust, horní propust, pásmový FT filtr

Morfologická analýza - základní morfologické operace (eroze, dilatace, otevření, uzavření) a jejich vlastnosti

Sylabus

Poslední úprava: doc. RNDr. Jan Malínský, Ph.D. (08.09.2011)

Fluorescenční mikroskopie v buněčné biologii

(syllabus přednášky; 2/0)

1. Základy mikroskopie - princip mikroskopu, zvětšení, limity zobrazení (Airyho disk, Rayleighovo kritérium). Práce s mikroskopem - Köhlerovo osvětlení a jak ho nastavit, olejová imerze, druhy objektivů, fázový kontrast, diferenciální interferenční kontrast.

2. Fluorescenční mikroskop. Luminiscence (fluorescence, fosforescence) - fyzikální podstata jevu, Jablonskiho diagram, příklady. Bioluminiscence. Fluorescenční spektrum (fluorofory v roztoku, quantum dots). Konstrukce fluorescenčního mikroskopu (zdroj světla - Hg výbojka, filtry, polopropustná zrcadla, detektor - CCD kamera), vlastnosti zobrazení, výhody oproti zobrazení ve světlém poli.

3. Konfokální mikroskop. Princip a konstrukce, historický exkurs, výhody a nevýhody oproti konvenčnímu mikroskopu. Skenovací mikroskop vs. spinning (Nipkow) disk. Speciální optické prvky: AOTF, AOBS, monochromátory, fotonásobič.

4. Snímání mikroskopického obrazu - obraz jako kompromis. Digitalizace obrazové informace. Šum detektoru (rozdíl mezi CCD kamerou a fotonásobičem, efekt chlazení detektoru), photobleaching, rychlost snímání, šíře spektra snímaného signálu…poměr signál/šum jako kritérium kvality obrazu. Úprava kontrastu. Spektrální separace fluorescenčních signálů, numerické metody jejího vylepšení.

5. Analýza mikroskopického obrazu. Kvantitativní měření intenzity fluorescence, morfologická měření, hodnocení vzájemné lokalizace dvou fluoroforů. 2D-scatterplot, kroskorelační funkce.

6. Biosensory, geneticky kódované fluorescenční značení proteinů. Mikroskopická měření koncentrací iontů, pH, membránového potenciálu. Tetracysteinové nekovalentní značky (FlAsH, ReAsH). GFP a další fluoreskující proteiny, speciální fluoreskující proteiny (GFP, timer, pHluorin).

7. Kinetická měření ve fluorescenčním mikroskopu. Snímání obrazu v čase, FRAP (FLIP, fotoaktivace, fotokonverze), FCS. Single particle tracking, mean square displacement.

8. Detekce inter- a intramolekulárních interakcí pomocí fluorescence. FRET, FLIM - podstata jevu, způsoby měření, aplikace. Spektrálně rozlišený obraz, multidimenzionální mikroskopie.

9. Restaurace obrazu - obrazová dekonvoluce. Mikroskopické zobrazení jako konvoluce, zobrazovací funkce mikroskopu (point spread function), principy inverzní transformace: přímá filtrace, iterační metody. PALM, korelativní mikroskopie.

10. Možnosti dalšího zvýšení prostorového rozlišení fluorescenčního mikroskopu. Nedokonalosti konfokálního zobrazení: limity rozlišení v laterálním a axiálním směru, absorpční hloubkový limit. Metody řešení: multifotonová mikroskopie, TIRF, SPIM, STED, strukturovaná iluminace.

11. Zpracování mikroskopického obrazu. Lineární filtrace, eliminace šumu, morfologická analýza, Fourierova transformace - hranové a pásmové filtry, princip automatického ostření mikroskopu.

12. Úprava mikroskopického obrazu pro vědeckou publikaci. Vhodné, nevhodné a neomluvitelné způsoby zpracování mikroskopického obrazu.