Poslední úprava: Mgr. Václav Vopálenský, Ph.D. (09.10.2020)
Výuka kurzu Metody stanovení genové exprese se bude konat klasickou prezenční formou za dodržení všech platných nařízení v době konání praktického kurzu.
Kurz se skládá z teoretické a praktické části. Stěžejní část kurzu je věnována kvantitativnímu PCR a práci s RNA.
Nedílnou součástí cvičení je demonstrace použití nejčastějších metodických přístupů pro detekci a kvantifikaci
jednotlivých fází genové exprese za použití jednoho modelového genu. Kurz je určen nejen pro magisterské
studenty a doktorandy buněčné a molekulární biologie, ale je i vhodný pro další zájemce z široké škály dalších
biologických oborů, kteří ve své práci potřebují stanovit genovou expresi. Kurz probíhá jako turnusové třídenní praktikum.
Poslední úprava: RNDr. Tomáš Mašek, Ph.D. (22.08.2017)
The course is composed of the theoretical and the practical parts. Pivotal part of the course is dedicated to qPCR
and work with RNA. The most common experimental approaches for detection and quantification of gene
expression in its different phases will be demonstrated on one gene model.
The course is intended for cell and molecular biology MSc. and PhD. students, but it is also suitable for those
interested in gene expression determination methods from a wide variety of biological sciences. The course is organized as 3-day-turnus and is also accessible to english-speaking students.
Literatura -
Poslední úprava: RNDr. Tomáš Mašek, Ph.D. (22.08.2017)
K tomuto kurzu není doporučená literatura. Studenti obdrží protokoly s dalšími informacemi v průběhu praktických cvičení.
Poslední úprava: RNDr. Tomáš Mašek, Ph.D. (22.08.2017)
No original textbooks are available. All manuals, protocols and other directions will be provided during the course.
Požadavky ke zkoušce -
Poslední úprava: RNDr. Tomáš Mašek, Ph.D. (22.08.2017)
Studenti ukončí praktikum vypracováním protokolů a složením zápočtového testu. Více informací, texty, protokoly a presentace jsou pro studenty zapsané do kurzu k dispozici na http://web.natur.cuni.cz/~pospisek.
Poslední úprava: RNDr. Tomáš Mašek, Ph.D. (22.08.2017)
Students must pass examination test and provide correct working protocols. Other information including recommended literature, presentations and protocols are available on the webpage (http://web.natur.cuni.cz/~pospisek).
Sylabus -
Poslední úprava: RNDr. Tomáš Mašek, Ph.D. (22.08.2017)
V teoretické části tohoto kurzu budou vysvětleny nejen základní principy prováděných metod, ale i jejich výhody a limitace. Studenti též budou seznámeni se správným plánováním vhodného uspořádání experimentů, s vyhodnocováním dat a interpretací výsledků.
Praktická část bude demonstrována především na modelovém reportérovém genu pod kontrolou inducibilního promotoru.
Úlohy:
1/ Příprava pracoviště, laboratorního skla, plastiku a elektroforetických tanků pro práci s RNA. Vysvětlení principů práce s RNA. Izolace celkové RNA, stanovení její koncentrace, analýza pomocí denaturační agarózové elektroforézy, odstranění kontaminující DNA, syntéza cDNA.
2/ Srovnání klasického RT PCR s qPCR, relativní a absolutní kvantifikace transkriptu.
3) Stanovení počtu genových kopií – qPCR (vyhodnocení dat).
4/ Western blot
5/ Měření aktivity luciferázy, zhodnocení růstových vlastností buněk s různou mírou aktivity inducibilního promotoru.
Poslední úprava: RNDr. Tomáš Mašek, Ph.D. (22.08.2017)
Principles of the demonstrated methods, their advantages and limitations are explained in the theoretical part of the course. Experimental design, data evaluation and results interpretation will be also discussed.
In the practical part, we employ model gene reporter under the control of an inducible promoter.
Tasks:
1/ Principles of the work with RNA (preparation of solutions, disposables and other equipment). Total RNA isolation, concentration determination, RNA quality analysis using RNA denaturing agarose electrophoresis, DNaseI treatment, cDNA synthesis.
2/ RT PCR and qPCR approach comparison, absolute and relative quantification.
3/ Gene copy number determination by qPCR (data evaluation).
4/ Western blot
5/ Evaluation of inducible promoter activity by luciferase activity measurement and by cell growth determination.
