|
|
|
||
|
Poslední úprava: Mgr. Václav Vopálenský, Ph.D. (18.01.2024)
Hlavním cílem tohoto kursu je seznámit studenty zejména 2. (či 3.) ročníku s metodami molekulární biologie s ohledem na možné využití těchto metod v laboratorní praxi studentů a se zřetelem na objasnění principů prováděných metod. V kursu se provádějí jak základní techniky molekulární biologie (např. izolace nukleových kyselin a proteinů), tak metody pokročilé (RT-PCR, RQ-PCR, STR analýza, klonování, produkce rekombinantních proteinů, luminiscenční techniky). |
|
||
|
Poslední úprava: Mgr. Václav Vopálenský, Ph.D. (24.08.2017)
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press Sambrook J., Russell D.W., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press Vondrejs V. (1997, 2001, 2003), Genové inženýrství I-III, Karolinum Brown T.A. (2006) Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction; Blackwell Publishing Incorporated |
|
||
|
Poslední úprava: Mgr. Václav Vopálenský, Ph.D. (18.01.2024)
Podmínky pro udělení zápočtu jsou následující: 1/ aktivní účast na praktiku (je povolena jedna půldenní absence během celého turnusového praktika) 2/ vypracování kompletních protokolů (včetně teoretických úloh), a jejich následné uznání vedoucím praktika 3/ výstupní test, který se skládá z cca 10-15 otázek týkajících se látky přednášené na praktiku. Časovým limit výstupního testu je 120 minut, minimální hranicí nutnou ke klasifikaci testu jako splněného je 60% správných odpovědí. |
|
||
|
Poslední úprava: Mgr. Václav Vopálenský, Ph.D. (24.08.2017)
Úlohy řešené v průběhu praktik: 1. Konstrukce bakteriálního expresního vektoru, produkce a purifikace GFP. Jedná se o jednu z nosných úloh praktika, v jejímž průběhu si studenti osvojí základní postupy molekulárně biologické praxe jako je PCR, restrikční štěpení, agarózová elektroforéza, izolace DNA z gelu, ligace, různé typy transformace transformace bakterií, neradioaktivní hybridizace pomocí digoxigeninem značené sondy, minipreparace bakteriální plasmidové DNA, produkce rekombinantních proteinů v bakteriálním expresním systému a sledování fluorescence zeleného fluorescenčního proteinu in vivo. 2. Izolace plasmidové DNA a její sekvenace. Jedna z klasických metod molekulární biologie; účastníci praktika vyizolují pomocí tzv. alkalické metody bakteriální plasmidovou DNA, tuto přečistí a následně osekvenují metodou terminace řetězce (tzv. Sangerovo sekvenování). Výslednou sekvenci studenti anotují pomocí molekulárně biologických databází. 3. Izolace proteinů pomocí afinitní chromatografie. V této úloze se studenti naučí produkovat cizorodé proteiny v bakteriálním expresním systému a tyto proteiny následně purifikovat, detekovat a ověřovat jejich funkčnost či aktivity. Součástí této úlohy příprava bakteriálních lyzátů, proteinová elektroforéza v SDS gelech, izolace proteinů pomocí afinitních chromatografií, imunodetekce izolovaných proteinů na pevném nosiči (tj. western blot) a ověření funkčnosti afinitně purifikovaných proteinů pomocí enzymatických přístupů. 4. Práce s reportérovými geny u kvasinek; v průběhu této úlohy se posluchači naučí práci s kvasinkovými kulturami (transformace kvasinek, testování auxotrofií), včetně stanovení normalizované aktivity luciferázy a betagalaktosidázy v kvasinkových lyzátech pomocí luminiscenčních přístupů. 5. Analýza nukleových kyselin; úloha zahrnující několik různých postupů využívaných při izolaci DNA a RNA z kvasinek (izolace chromozomální a plasmidové DNA) a rostlin (izolace celkové RNA včetně následné reverzní transkripce (RT-PCR)). 6. Forenzní analýza DNA; izolace lidské DNA z bukálních výtěrů, určení krevních skupin a STR profilů účastníků praktika včetně následného statistické hodnocení. 7. Fúzní PCR, účastníci tohoto praktického kurzu si vyzkouší jednu z komplikovanější strategií PCR, takzvané fúzní (slučovací) PCR s využitím dvou nezávislých templátových molekul. 8. Stanovení exprese genů s využitím kvantitativního PCR (RQ-PCR); v této úloze budou studenti, pomocí absolutní kvantifikace, stanovovat počet kopií lidského genu naklonovaného v plazmidu, včetně následného statistického vyhodnocení. 9. Teoretické úlohy; průběžně v průběhu praktika (bioinformatika, práce s databázemi, navrhování primerů, vyhledávání genů, výukové molekulárně biologické programy, dvouhybridní systémy, anotace neznámé sekvence in silico apod.). |