Poslední úprava: Mgr. Michal Štefánek (31.05.2020)
Praktická výuka metod sekvenování DNA a mikrosatelitů s důrazem na jejich využití v systematice a populační
biologii rostlin. Kurz je koncipován formou vědeckého projektu a zahrnuje přípravu projektu, práci v laboratoři,
interpretaci dat ze sekvenátoru a přípravu datových matic, vyhodnocování dat a celkové vyhodnocení a prezentaci
projektu. Kromě hodnocení klasických sekvenačních a mikrosatelitových dat je kurz věnován i základům přípravy
knihoven pro next-generation sequencing (NGS) a analýzy NGS dat.
Předmět je vyučován v rámci projektu CZ.02.2.69/0.0/0.0/18_056/0013322 s názvem ESF pro VŠ II na UK.
Poslední úprava: Mgr. Michal Štefánek (31.05.2020)
Specialized practical course of molecular methods in plant systematics and population biology. Two methods will
be demonstrated: microsatellites and DNA sequencing. The course includes lab work, evaluation of the data from
sequencer, data analysis and presentation. The basics of next-generation (NGS) sequencing libraries and NGS
data analysis are also demonstrated.
The course is established within the project CZ.02.2.69/0.0/0.0/18_056/0013322 with the name ‘ESF pro VŠ II na
UK‘.
Literatura -
Poslední úprava: Mgr. Michal Štefánek (31.05.2020)
Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.
Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.
Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.
Poslední úprava: Mgr. Michal Štefánek (31.05.2020)
Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.
Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.
Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.
Požadavky ke zkoušce -
Poslední úprava: Mgr. Michal Štefánek (31.05.2020)
Vypracované protokoly k řešeným úkolům podle pokynů přednášejícího.
Poslední úprava: Mgr. Michal Štefánek (31.05.2020)
Write out protocols from the practical part.
Sylabus -
Poslední úprava: Mgr. Michal Štefánek (31.05.2020)
Praktické cvičení zahrnuje práci v laboratoři (část A), interpretaci dat ze sekvenátoru a přípravu datových matic (část B), vyhodnocování dat (část C) a základní praktikum analýzy next-generation sequencing (NGS) dat (část D).
A: Laboratorní práce - 2 dny
A1. sekvenování DNA
příprava a odladění PCR amplifikace požadovaného úseku DNA (nekódující úseky cpDNA, ITS…)
otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu
přečištění PCR fragmentu pomocí kitu
kvantifikace PCR produktu (změření koncentrace na spektrofotometru)
vlastní sekvenační reakce (cycle sequencing) pomocí kitu ABI PRISM BigDye Terminator v3.1
přečištění produktu, příprava pro analýzu na sekvenátoru
použití automatického sekvenátoru ABI 3130xl Avant na biologické sekci PřF UK
A2. mikrosatelity
použití specifických primerů pro jaderné mikrosatelity (PCR reakce)
použití univerzálních pro chloroplastové mikrosatelity (PCR reakce)
otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu
precipitace PCR produktů, příprava pro analýzu na sekvenátoru
fragmentační analýza na sekvenátoru ABI 3100xl Avant na biologické sekci PřF UK
A3. příprava knihoven pro NGS
sonikace DNA na přístroji Covaris M220, test na gelu
příprava knihovny pomocí kitu NEBNext Ultra II
kvantifikace knihovny na přístroji Qubit nebo LabChip
B: Interpretace dat ze sekvenátoru - 1 den
B1. sekvenování
editace sekvenčních dat (FinchTV aj.) ze sekvenátoru, příprava pro alignment
automatický alignment v programu ClustalX a MAFFT
úprava alignmentu, manipulace se sekvencemi - BioEdit, FaBox
B3. mikrosatelity
jednoduchá analýza získaných dat v programu GeneMarker
vysvětlení problému se stutter bands, -A addition ad., příprava datové matice pro další analýzy
C: Analýza datových matic - 1 den
C1. sekvenování
vyhledávání podobných sekvencí v GenBank (BLAST)
základní tvorby stromů (FastTree)
kodování indelů - SeqState
statistické parsimonické sítě - TCS
příprava datové matice pro další analýzy (NEXUS, PHYLIP formát ad.), konverze mezi formáty
C2. mikrosatelity
základní analýza dat (MicroSatelliteAnalyser)
AMOVA (Arlequin)...
D: základní analýza NGS data - 1 den
získávání FASTQ dat ze short read archive (fastq-dump)
analýza a hodnocení kvality (FastQC), trimming (Trimmomatic), odstranění duplikátů (fastuniq)
mapování readů na referenci (BWA)
analýzy namapovaných readů (samtools, Tablet)
de-novo assembly chloroplastového genomu (Velvet)
automatická anotace (web GeSeq)
Poslední úprava: Mgr. Michal Štefánek (31.05.2020)
The practical course includes lab work (part A), interpretation of the sequencer data and preparing data matrices (part B), data analysis (part C), and basics of next-generation (NGS) data analysis (part D).
A: Lab work - 2 days
A1. DNA sequencing
PCR amplification of the target DNA region (non-coding cpDNA region, ITS…)
agarose gel electrophoresis (test of successful PCR amplification)
