Separační, analyt. a značící metody nízkomolek. slouč. a proteinů - MB150P24

• Anglický název: Separation, Analytical, and Labeling Methods of Low Molecular Weight Molecules and Proteins
• Zajišťuje: Katedra buněčné biologie (31-151)
• Fakulta: Přírodovědecká fakulta
• Platnost: od 2011 do 2012
• Semestr: letní
• E-Kredity: 4
• Způsob provedení zkoušky: letní s.:
• Rozsah, examinace: letní s.:2/1, Zk [HT]
• Počet míst: neomezen
• Minimální obsazenost: neomezen
• 4EU+: ne
• Virtuální mobilita / počet míst pro virtuální mobilitu: ne
• Stav předmětu: vyučován
• Jazyk výuky: čeština
• Poznámka: povolen pro zápis po webu
• Garant: Mgr. Petr Jedelský
• Vyučující: Mgr. Petr Jedelský

Anotace

čeština

Poslední úprava: JEDELSKY/NATUR.CUNI.CZ (26.02.2013)

Přednáška začíná přehledem základních biochemických technik jako čistota vody, filtrace, centrifugace, pH a pufry, spektrofotometrie a statistika. Pokračuje metodami purifikace proteinů s důrazem na chromatografii a elektroforézu. Další část tvoří modifikace proteinů a jejich značení. Závěr je věnován vizualizaci markerů a aplikacím: histochemie, fluorescence, in situ techniky, imunohistochemie a genetické markery. Příklady metod jsou demonstrovány na praktickém cvičení. Předmět je doporučen pro studenty magisterského a postgraduálního stupně studia.

angličtina

Poslední úprava: JEDELSKY/NATUR.CUNI.CZ (26.02.2013)

Please note, the lectures are given in czech language only.

The lecture starts with survey of basical biochemical techniques, like water purity, filtration, centrifugation, pH and buffers, spectrophotometry and statistics. It continues by protein purification methods with emphasis on chromatography and electrophoresis. Next part is protein modification and labelling. Final part is devoted to visualisation of labels and applications: histochemistry, fluorescence, in situ techniques, immunohistochemistry and genomic markers.

Literatura

Poslední úprava: JEDELSKY/NATUR.CUNI.CZ (26.09.2011)

Pro přednášku jsou doporučené tyto knihy, které jsou dostupné na books.google.com

základní literatura:

Walker J. M. (2002): The protein protocols handbook. 2.vydání Humana Press, Totowa, ISBN: 0-89603-940-4

Doplňková literatura:

Hermanson G. T. (2008): Bioconjugate techniques. 2. vydání. Academic Press, ISBN: 978-0123705013

Požadavky ke zkoušce

Poslední úprava: JEDELSKY/NATUR.CUNI.CZ (26.09.2011)

Ústní zkouška zahrnuji diskusi tématu bakalářské (popř. magisterské či dizertační) práce, představení elektroforetické či chromatografické metody dle vlastního výběru a zodpovězení otázek o dalších metodách diskutovaných při přednášce.

Sylabus

čeština

Poslední úprava: PUTA (29.03.2004)

1. Základní pracovní techniky.
Voda: nečistoty, reversní osmóza, deionizace, tkáňové kultury. Mytí nádobí, TK, molekulární metody, plastik. Krystalizace, odpařování, zahušťování, filtrace, ultrafiltrace, dialýza, lyofilizace, měření pH. Centrifugace. Smáčedla typy, micely. Vyhodnocení výsledků a statistika.

2. Chromatografie.
Princip: teoretické patro, vysokoúčinnostní chromatografie.

Plynová: Adsorpční, kapilární, detekce- plamenový detektor, ECD, hmotová spektroskopie. Aparatura, příprava derivátů.

Kapalinová: Kolonová, tenkovrstevná, a papírová, detekce - UV, index lomu, reakce, aparatury.

Adsorpční : Polarita, sorbenty, donor - akceptor, elutropní řada rozpouštědel.

Rozdělovací: Sorbenty, obrácená fáze, hydrofobní. Molekulární síta : Princip, skelety.

Ionexová : Princip, skelety, funkční skupiny, afinity iontů, eluce. Ionexy v čištění vody a záměně iontů. Cyklování.

Afinitní: Ligandy, skelety, spacer a nespecifická interakce spaceru. Aktivace skeletů, stavba spaceru. Eluce biospecifická a ?deformační".

3. Analytické metody.
Spektrofotometrie: Absorbance, měření při dvou vlnivých délkách, molární extinkční koeficient. Jedno- a dvoupaprskové spektrofotometry, průtokové přístroje.

Elektroforéza: Volná, v nosiči a gelová. Kontinuální a diskontinuální pufry, isoelekrická a isotachoforeza. Denaturace, komplexy proteinů a elektroforeza. Bloting, detekce a densitometie, immunodetekce a immunoelektroforeza.

4. Proteiny.
Optické vlastnosti, rozpustnost a denaturace. Stanovení - srážení kys.trichloroctovou a chloristou, UV absorbce, Folinova reakce a stanovení Bradfordové. Detekce - barveni stříbrem, coomasie blue a fluorescencí. Zásahy do terciální a sekundární struktury : disociace subjednotek, s-s můstky. Selektivní štěpení - proteázy , CNBR. Isolace proteinů: Homogenizace a uvolňování ze struktur, smáčedla. Vysolování, srážení rozpouštědly, selektivní srážení, selektivní denaturace, chromatografické metody, krystalizace, immunoprecipitace.

Modifikace: aminoskupina-sukcinylace, maleilace, dinitrofluorbenzen, TNBS, estery hydrosukcimidu a nitrofenolu, isothiokyanáty a dansylchlorid, iminoestery, aldehydy a redukce Shiffových bazí. Sulfhydrylová skupina - merkaptoetanol, DTT a DTE, borohydrid, tetrathionát, karboxymethylace,ethylmaneinimid a dansylaziridin, dithiobisnitrobenzoová kyselina. Tyrosin- radiojodace a azpulace. Cukry - glykosidázy, jodistan, kyanoborohydrid.

Kroslinkování: Homobifunkční činidla, fixace glutaraldehydem, heterobifunkční činidla,značení proteiny.

Fluorescenční značení: excitace a emise, resonanční zhášení, účinnost, filtry a mikroskopie. Barviva a jejich deriváty, užití v chromatografii. Fluorescenční deriváty nukleotidů, sekvenace. Přímá a nepřímá immunofluorescence, značení DNA, FISH, celochromozomální sondy a jejich příprava.

Detekce enzymů: srážecí metody, azokopulační metody, tetrazoliové soli a dehydrogenázy, indoxylové metody, peroxidáza. Značení enzymy. Peroxidáza, fosfatáza, galaktosidáza, ureáza. Chemiluminiscence. Biotin - avidin/streptavidin, hapteny- digoxigenin- antidigoxygenin.

Značení zlatem: Koloidní zlato a interakce s proteiny, zesílení katalyzovanou redukcí stříbra.

5. Molekulární přístup.
Fúzní a tagované proteiny, expresní vektory.

angličtina

Poslední úprava: PUTA (29.03.2004)

The syllabus is available in Czech only.