|
|
|
||
|
Praktikum fluorescenční spektroskopie s biologickými a biochemickými aplikacemi. Zahrnuje úvod do fluorescenčních metod, úvody k jednotlivým úlohám a jejich praktické provedení v oblastech: měření spekter, zhášení fluorescence, polarizovaná fluorescence, FRET, fluorescence proteinů, dynamika biologických membrán, měření fyziologických charakteristik živých buněk. Časově rozlišená fluorescence. Analýza mikroskopického obrazu.
Poslední úprava: Lišková Petra, RNDr., Ph.D. (18.08.2015)
|
|
||
|
Joseph R. Lakowicz (2006): Principles of Fluorescence Spectroscopy , 3 edition, Springer Poslední úprava: Lišková Petra, RNDr., Ph.D. (18.08.2015)
|
|
||
|
K zápočtu jsou nutné kompletní protokoly v excelovském souboru, který je pro kazdy rok inovovan vyucujicimi podle probihajicich uloh. Excelovsky soubor se posila k datu, ktere je urceno na konci cviceni. Poslední úprava: Lišková Petra, RNDr., Ph.D. (18.08.2015)
|
|
||
|
Stránky předmětu: http://web.natur.cuni.cz/~konop/ss_index.php Dotazy pište na fluorescence.spectroscopy[at]gmail.com
1. Teoretická část - přednáška: Úvod do fluorescenční spektroskopie. Jablonského diagram, emisní spektra a jejich změny, doba života excitovaného stavu, fluorescenční sondy a informace o nich, zhášení fluorescence a jeho typy, FRET, polarizovaná fluorescence, časově rozlišená fluorescence, spektrofluorometry.
2. Praktická část - úlohy:
a) Kalibrace fluorometru, excitační a emisní spektra používaných sond, intenzita, spektra a polarita prostředí, vliv pH na spektra. Artefakty (vnitřní filtr, pozadí, korekce spekter, Ramanův rozptyl). Navržení optimálních podmínek pro pokus "v kyvetě" a pro pokus s konfokálním mikroskopem.
b) Trp a Tyr jako přirozené fluorofory. Spektra Trp v proteinech, jejich změny při oligomerizaci a při zabudování do biologické membrány.
c) Zhášení fluorescence v roztoku, kombinace sondy a zhášeče pro sledování úniku obsahu lipozomů, lyze lipozomů účinkem bakteriálního toxinu, zhášení fluorescence Trp u membránového proteinu v roztoku a v membráně.
d) Polarizovaná fluorescence. Anizotropie fluorescence, membránová fluidita, teplota a fázové přechody v syntetických lipidech a biologických membránách, fluidizace biologických membrán (artefakty: rozptyl a polarizace, korekce dat u složitějších biologických vzorků).
e) Měření fluorescence na živých buňkách: poměrové měření fluorescence a změny koncentrace vápníku v buňkách. Využití mikrodestiček pro fluorescenční měření.
f) Měření časově rozlišené fluorescence: stanovení koncentrace iontů Cl- (zhášení), změna konformace proteinu (FRET).
g) Konfokální mikroskopie: měření spekter, poměrové měření (Laurdan - fluidita buněčných mebrán), porovnání s měřením ve spektrofluorometru.
h) Sledování endocytózy patogenní bakterie Bordetella myšími makrofágy - sledování živých buněk, kolokalizace, kvantifikace endocytózy
Používaný software: Fityk (http://www.unipress.waw.pl/fityk/), analýza spekter, histogramů, kinetik, nelineární regrese WCIF ImageJ (http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/imagej/), analýza mikroskopického obrazu Poslední úprava: Lišková Petra, RNDr., Ph.D. (18.08.2015)
|
|
||
|
Kurzu předchází přednáška a vstupní test. Výhodné je absolvování kurzu biochemie, nutná znalost práce s programem MS Excel, Gnumeric nebo OpenOffice Calc. Pro zpracování výsledků během kurzu je nezbytný vlastní notebook (Wi-Fi). Poslední úprava: Lišková Petra, RNDr., Ph.D. (18.08.2015)
|