Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.

Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.

Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.

Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.

Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.

Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.

Vypracované protokoly k řešeným úkolům podle pokynů přednášejícího.

write out protocols

Praktické cvičení zahrnuje přípravu projektu (část A), práci v laboratoři (část B), interpretaci dat ze sekvenátoru a příprava datových matic (část C), vyhodnocování dat (část D) a celkové vyhodnocení a prezentaci projektu (část E). Jednotlivé části na sebe nutně nemusí časově navazovat, předpokládá se i samostatná domácí práce studentů.

A: přípravná fáze (samostatná práce studentů ve skupinách) - 2 dny

• seznámení studentů s projektem

• vyhledávání dosavadních informací o studované skupině (Web of Science, on-line zdroje PřF UK, knihovna Katedry botaniky…)

• formulace otázek, které bude možné řešit pomocí molekulárních metod; zjistit, které molekulární metody bude vhodné použít

• zjištění informací o metodice odběru vzorků z živého materiálu a možnostech extrakce DNA (s důrazem na studovanou skupinu)

• seznámení se studovanou skupinou (sbírka Botanické zahrady UK)

• zhotovení seznamu objektů, které budou molekulárně studovány

• prezentace jednotlivých pracovních skupin o zjištěných informacích

• sestavení cílů projektu a metodiky

B: laboratorní práce - 4 dny

B1. sekvenování DNA

• příprava a odladění PCR amplifikace požadovaného úseku DNA (nekódující úseky cpDNA, ITS…)

• otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu

• přečištění PCR fragmentu pomocí kitu

• kvantifikace PCR produktu (změření koncentrace na fotometru)

• vlastní sekvenační reakce (cycle sequencing) pomocí kitu ABI PRISM BigDye Terminator v3.1

• přečištění produktu, příprava pro analýzu na sekvenátoru

• použití sekvenátoru ABI 3130 Avant na biologické sekci PřF UK

B2. AFLP

• restrikce celkové DNA pomocí kitu AFLP Core Reagent Kit (Invitrogen)

• ligace adaptorů k restrikčním fragmentům pomocí téhož kitu

• preamplifikace pomocí kitu AFLP Pre-Amp Primer Mix I (Invitrogen)

• selektivní amplifikace s fluorescenčně značeným primerem

• precipitace PCR produktů, příprava pro analýzu na sekvenátoru

• fragmentační analýza na sekvenátoru ABI 3100 Avant na biologické sekci PřF UK

B3. mikrosatelity

• použití specifických primerů pro jaderné mikrosatelity (PCR reakce)

• použití univerzálních pro chloroplastové mikrosatelity (PCR reakce)

• otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu

• precipitace PCR produktů, příprava pro analýzu na sekvenátoru

• fragmentační analýza na sekvenátoru ABI 3100 Avant na biologické sekci PřF UK

C: interpretace dat ze sekvenátoru - 0,5 dne

C1. sekvenování

• editace sekvenčních dat (FinchTV aj.) ze sekvenátoru, příprava pro alignment

• automatický alignment v programu ClustalX

• úprava alignmentu v programu BioEdit

• příprava datové matice pro další analýzy (NEXUS formát ad.)

C2. AFLP

• analýza získaných dat v programu GeneScan

• vyhodnocování AFLP dat v programu Genographer, příprava datové matice pro další analýzy

C3. mikrosatelity

• jednoduchá analýza získaných dat v programu GeneMarker

• vysvětlení problému se stutter bands, -A addition ad., příprava datové matice pro další analýzy

D: analýza datových matic - 1,5 dne

C1. sekvenování

• vyhledávání podobných sekvencí v GenBank (BLAST)

• distanční metody (TreeCon, PAUP)

• maximální parsimonie, maximum likelihood (PAUP, Modeltest)

• Bayesovská analýza (MrBayes)

D2. AFLP

• tvorba stromů (TreeCon)

• mnohorozměrné analýzy (FAMD)

• AMOVA (Arlequin, FAMD)

• zacházení s chybějícími daty (FAMD)...

D3. mikrosatelity

• základní analýza dat (MicroSatelliteAnalyser)

• AMOVA (Arlequin)...

E: celkové vyhodnocení a prezentace projektu - 2 dny

• diskuse nad výsledky v souvislosti se znalostmi rozšíření, biologie a ekologie jednotlivých zkoumaných druhů

• srovnání výsledků s použitím různých metod, interpretace

• srovnání molekulárně-fylogenetických výsledků s morfologií jednotlivých taxonů

• příprava prezentace výsledků projektu (tabulky, fylogenetické stromy, mapy rozšíření…)

• příprava plakátového sdělení (posteru) o výsledcích projektu - základní pravidla pro tvorbu posterů, jak zaujmout a jasně prezentovat důležité výsledky

• prezentace výsledků formou přednášek jednotlivých studentů (minikonference)

Practical course includes lab work (part A), interpretation of the sequencer data and preparing data matrices (part B), and data analysis (part C).

A: lab work

A1. DNA sequencing

• PCR amplification of the target DNA region (trnL-trnF or other non-coding cpDNA region, ITS…)

• agarose gel electrophoresis (test of successful PCR amplification)

• cleaning of PCR fragments using kit

• PCR product quantification (photometrically)

• cycle sequencing using ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 kit

• product precipitation

• sequencing run at ABI 3100 Avant (Biological section of the Faculty of Science)

A2. AFLP

• total DNA restriction using AFLP Core Reagent Kit (Invitrogen)

• adaptor ligation

• preamplification using AFLP Pre-Amp Primer Mix I (Invitrogen)

• selective amplification with fluorescence-labelled primers

• PCR product precipitation, mixing with ROX internal standard

• fragment analysis run at ABI 3100 Avant (Biological section of the Faculty of Science)

A3. microsatellites

• use of specific nuclear primers (PCR reaction)

• use of universal chloroplast primers (PCR reaction)

• agarose gel electrophoresis (test of successful PCR amplification)

• PCR product precipitation, mixing with ROX internal standard

• fragment analysis run at ABI 3100 Avant (Biological section of the Faculty of Science)

B: sequencer data interpretation

B1. DNA sequencing

• editing of sequences (FinchTV etc.)

• automatic alignment using ClustalX

• alignmentu editing in BioEdit

• building of data matrices

B2. AFLP

• data analysis in GeneScan

• data evaluation in Genographer, building of data matrices

B3. microsatellites

• data analysis in GeneMarker

• interpreting stutter bands, -A addition etc., building of data matrices

C: data analysis

C1. DNA sequencing

• distance methods (TreeCon)

• maximum parsimony, maximum likelihood (PAUP)

• Bayesian analysis (MrBayes)

C2. AFLP

• tree building (TreeCon)

• multidimensional methods (Canoco, SYNTAX)

• AMOVA (Arlequin)

• missing data handling (FAMD)...

C3. microsatellites

• basic data analyses (MicroSatelliteAnalyser)

• AMOVA (Arlequin)...