Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.

Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.

Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.

Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.

Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.

Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.

Vypracované protokoly k řešeným úkolům podle pokynů přednášejícího.

write out protocols

• úvod do problematiky, metody studia DNA, rozdíly mezi jednotlivými typy markerů

• extrakce DNA z rostlinného materiálu (CTAB metoda) - čerstvý i vysušený materiál

• elektroforéza, příprava agarosových minigelů, použití DNA markerů (žebříčků)

• práce s dokumentačním systémem Kodak Gel Logic 100

• stanovení koncentrace extrahované DNA pomocí UV fotometru, ředění DNA

2. den

• PCR amplifikace, příprava směsi pro reakci, metody optimalizace reakčních podmínek

• zacházením s termocyclerem Techne Touchgene a Mastercycler ep gradient S

• vytváření nových programů, využití gradientového bloku pro optimalizaci PCR reakce

• metoda RAPD

• elektroforéza získaných PCR produktů a jejich visualizace

• práce se softwarem pro analýzu gelů (KODAK 1D Image Analysis Software) - porovnání RAPD pattern, stanovení přibližné délky získaných PCR produktů

3. den (PCR-RFLP)

• amplifikace konkrétních úseků cpDNA pomocí universálních primerových párů

• optimalizace PCR amplifikace pomocí gradientového bloku

• elektroforéza - test úspěšné PCR

• PCR amplifikace s použitím optimální teploty annealingu

• štěpení získaných PCR produktů několika restrikčními enzymy

4. den

• příprava vertikálního polyakrylamidového gelu

• rozdělení restrikčních fragmentů podle délky na vertikálním polyakrylamidovém gelu

• gel staining - ethidiumbromidu nebo SYBR Green I

• visualizace restrikčních fragmentů dokumentačním systémem Kodak Gel Logic 100

• práce se softwarem pro analýzu gelů (KODAK 1D Image Analysis Software) - porovnávání restrikčních pattern, stanovení přibližné délky restrikčních fragmentů

5. den

• analýza dat z RAPD a PCR-RFLP, čtení gelů

• příprava dat pro další biosystematické a populačně-genetické analýzy

• fylogenetické analýzy a populačně-genetické analýzy použitím specializovaného software (TreeCon, SYNTAX, PopGen, Arlequin)

• introduction, methods of study of DNA, differences among molecular markers

• DNA extraction from plant material (CTAB method) - fresh and dried material

• electrophoresis, making agarose minigels, use of DNA ladders

• working with documentation system Kodak Gel Logic 100

• determining of DNA concentration using UV photometer, DNA dilution

2nd day

• PCR amplification, making PCR premix, methods of PCR optimization

• working with termocyclers Techne Touchgene and Mastercycler ep gradient S

• making new PCR programs, use of gradient block for PCR optimization

• RAPD method

• electrophoresis of PCR bands and their visualization

• working with the software for gel analysis (KODAK 1D Image Analysis Software) - comparison of RAPD patterns, determination of the lengths of PCR bands

3rd day (PCR-RFLP)

• amplification of specific regions of cpDNA using universal primer pairs

• PCR optimization using gradient block

• electrophoresis - test of successful PCR

• PCR amplification using optimal annealing temperature

• restriction of PCR bands with restriction endonucleases

4th day

• preparing vertical polyacrylamide gels

• separation of restriction fragments on the vertical polyacrylamide gel

• gel staining - ethidiumbromide or SYBR Green I

• visualization of restriction pattern using documentation system Kodak Gel Logic 100

• working with the software for gel analysis (KODAK 1D Image Analysis Software) - comparison of PCR-RFLP patterns, determination of the lengths of restriction fragments

5th day

• RAPD and PCR-RFLP data analyses, reading of gels

• data preparation for further biosystematics a population genetic analyses

• phylogenetic and population genetic analyses using specialized software (TreeCon, SYNTAX, PopGen, Arlequin)