Vývoj myšího modelu fokální kortikální dysplazie s použitím adeno-asociovaného viru pro transdukci subpopulace kortikálních neuronů v dospělosti.

• Název práce v češtině: Vývoj myšího modelu fokální kortikální dysplazie s použitím adeno-asociovaného viru pro transdukci subpopulace kortikálních neuronů v dospělosti.
• Název v anglickém jazyce: Development of a murine model of focal cortical dysplasia with using adeno-associated to transduce a subpopulation of cortical neurons in adulthood.
• Klíčová slova: Fokální kortikální dysplázie, adeno-asociovaný virus, mTOR dráha, dysmorfní neurony
• Klíčová slova anglicky: Focal cortical dysplasia, adeno-associated virus, mTOR pathway, dysmorphic neurons
• Akademický rok vypsání: 2023/2024
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
• Vedoucí / školitel: Mgr. Ondřej Novák, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 01.11.2023
• Datum zadání: 03.11.2023
• Datum potvrzení stud. oddělením: 17.01.2024

Seznam odborné literatury

Holtmaat A, Bonhoeffer T, Chow DK, Chuckowree J, De Paola V, Hofer SB, Hubener M, Keck T, Knott G, Lee WCA, Mostany R, Mrsic-Flogel TD, Nedivi E, Portera-Cailliau C, Svoboda K, Trachtenberg JT, Wilbrecht L (2009) Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols 4:1128-1144.
Lim JS, Kim WI, Kang HC, Kim SH, Park AH, Park EK, Cho YW, Kim S, Kim HM, Kim JA, Kim J, Rhee H, Kang SG, Kim HD, Kim D, Kim DS, Lee JH (2015) Brain somatic mutations in MTOR cause focal cortical dysplasia type II leading to intractable epilepsy. Nature Medicine 21:395-+.
Proietti Onori M, Koene LMC, Schafer CB, Nellist M, de Brito van Velze M, Gao Z, Elgersma Y, van Woerden GM (2021) RHEB/mTOR hyperactivity causes cortical malformations and epileptic seizures through increased axonal connectivity. Plos Biology 19.

Předběžná náplň práce

Fokální kortikální dysplazie (FCD) je vývojová malformace mozkové kůry spojená s rozvojem farmakorezistentní epilepsie. Jedná se o nejčastější indikaci k epileptochirurgickému výkonu u dětí. FCD se morfologicky klasifikuje na několik podtypů podle celkové cytoarchitektury v místě léze, typů přítomných buněk a eventuálnímu výskytu komorbidit. FCD typu IIa je charakterizována ztrátou laminární struktury v místě léze a výskytem ektopických neuronů z nich část má charakteristické morfologické vlastnosti, jako je obří tělo, všesměrovými odstupy silných dendritů a extenzivní ramifikací dendritického stromu. Pro tyto charakteristiky se tyto buňky nazývají jako dysmorfní neurony. Lokální výskyt léze implikuje původ v somatické mutaci. Skutečně, k dnešnímu dni byla pomocí hlubokého sekvenování vysvětlena etiologie u více jak ¾ vzorků histologicky charakterizovaných jako FCDIIa. Všechny tyto mutace spadají do PI3K/AKT/mTOR signalizační dráhy. Jedna z prvních identifikovaných mutací (mTOR c.7280T>C ; p.Leu2427Pro) byla použita pro tvorbu plazmidu, který byl následně vpraven do progenitorových buněk mozkové kůry pomocí in utero elektroporace (Lim et al., 2015). U těchto jedinců došlo ke vzniku FCD i s charakteristickými dysmorfními neurony a v rané dospělosti také k rozvoji spontánních epileptických záchvatů. Pozdější experimenty ukázaly, že pro vznik epilepsie není nutná ani postačující dezorganizace kůry, ale především přítomnost oněch dysmofních neuronů, buněk nesoucích mutaci, a že tyto buňky dokonce nemusejí mít mutaci aktivní již při vývoji, ale její aktivace v dospělosti je dostačující (Proietti Onori et al., 2021).
In utero elektroporace je metodika s velmi nízkým výtěžkem. Oproti tomu metoda chronického kraniálního okna (Holtmaat et al., 2009) s peroperační injekcí adeno-asociovaného viru (AAV), která je navržena pro tuto diplomovou práci, je metoda mnohem efektivnější. Cílem práce je vytvořit model FCD pomocí transdukce korové tkáně dospělých myší s použitím AAV nesoucích gen konstitutivně hyperaktivující PI3K/AKT/mTOR signalizační dráhu a replikovat epileptický fenotyp. Jako klíčový bude použit mutovaný gen RHEB (Ras homolog enriched in brain), jehož mutace RHEB c.110C>T (p.P37L) je mimořádně efektivní, a zároveň jde o malý gen pro kapacitu AAV. Současně s vysokým titrem AAV-RHEB bude do mozku injikován také nízký titr s promotorem CaMK2a a endonukleázou Cre. Mutovaný RHEB bude v AAV exprimován Cre-dependentně, takže titr druhého AAV bude nastavovat hustotu rekombinace (a takto vzniklých dysmorfních neuronů) v prostoru. Student/ka by měl/a charakterizovat fenotyp takto artificiálně vytvořené FCD v závislosti na hustotě dysmorfních neuronů, velikosti léze a korové oblasti, kde je léze umístěna. Tento model by měl sloužit pro urychlení dalších poznatků o mechanizmech FCD popřípadě jako vysokoprůtokový model pro farmaceutické testování.