Příprava oligosacharidů mateřského mléka enzymovými metodami

• Název práce v češtině: Příprava oligosacharidů mateřského mléka enzymovými metodami
• Název v anglickém jazyce: Production of human milk oligosaccharides by enzymatic methods
• Klíčová slova: E. coli; glykosidasa; glykosyltransferasa; oligosacharid mateřského mléka; syntéza
• Klíčová slova anglicky: E. coli; glycosidase; glycosyltransferase; human milk oligosaccharide; synthesis
• Akademický rok vypsání: 2023/2024
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra biochemie (31-250)
• Vedoucí / školitel: doc. RNDr. Pavla Bojarová, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 25.10.2023
• Datum zadání: 25.10.2023
• Datum potvrzení stud. oddělením: 26.01.2024

Seznam odborné literatury

Bode L, 2012. Human milk oligosaccharides: Every baby needs a sugar mama. Glycobiology 22, 1147-1162.
Mészáros Z, Nekvasilová P, Bojarová P, Křen V, Slámová K, 2021. Advanced glycosidases as ingenious biosynthetic instruments. Biotechnol. Adv. 49, 107733.
Nekvasilová P, Hovorková M, Mészáros Z, Petrásková L, Pelantová H, Křen V, Slámová K, Bojarová P, 2022. Engineered glycosidases for the synthesis of analogs of human milk oligosaccharides. Int. J. Mol. Sci. 23, 4106.
Zeuner B, Teze D, Muschiol J, Meyer AS, 2019. Synthesis of human milk oligosaccharides: protein engineering strategies for improved enzymatic transglycosylation. Molecules 24, 2033.
Laaf D, Bojarová P, Pelantová H, Křen V, Elling L, 2017. Tailored multivalent neo-glycoproteins: synthesis, evaluation, and application of a library of galectin-3-binding glycan ligands. Bioconjug. Chem. 28, 2832-2840.

Předběžná náplň práce

Enzymová syntéza je praktickou metodou pro produkci komplexních sloučenin, jako jsou oligosacharidy mateřského mléka (human milk oligosaccharides, HMOs). Tyto látky jsou zásadní pro zdravý vývoj novorozence, mají pozitivní vliv na jeho imunitní systém i další biologické aktivity. In vivo jsou HMOs syntetizovány glykosyltransferasami (EC 2.4), které využívají jako substráty cukerné nukleotidy. Syntéza glykosyltransferasami je dražší, ale vysoce regioselektivní a výtěžná. Alternativní volbou pro syntézu HMOs jsou glykosidasy (EC 3.2.1), popř. jejich mutantní varianty. Glykosidasy využívají jako substráty levnější p-nitrofenyl-glykosidy nebo glykosyl-fluoridy a dobře tolerují modifikace substrátové molekuly, ale jsou méně regioselektivní a reakce s nimi mohou mít nižší výtěžky. Ačkoliv existuje řada prací o enzymové syntéze HMOs, jejich příprava je stále netriviální a možnosti syntézy HMOs značených funkčními skupinami, např. pro multivalentní prezentaci, jsou do značné míry neprozkoumané.
Obsahem teoretické části práce bude charakterizace HMOs a jejich biologických účinků a popis dosavadních znalostí o jejich syntéze. Cílem praktické části práce bude chemo-enzymová příprava lakto-N-triosy II (GlcNAcβ3Galβ4Glc) nesoucí na C-1 aminovou nebo azidovou funkční skupinu. Pro tento účel bude použita rekombinantní beta3-N-acetylglukosaminidasa z Bifidobacterium bifidum, případně její mutantní varianta, a/nebo rekombinantní beta3-N-acetylglukosaminyltransferasa z Helicobacter pylori. V dalším kroku bude studována beta4-galaktosylace připravené lakto-N-triosy II, a to beta3-galaktosynthasou z Bacillus circulans a/ nebo beta4-galaktosyltransferasou z lidské placenty (geny jsou dostupné na pracovišti). Bude optimalizována produkce a purifikace těchto enzymů a uspořádání syntetické reakce pro maximální výtěžek.

Metody: práce s DNA, transformace a kultivace E. coli, produkce a purifikace rekombinantních proteinů, stanovení enzymové aktivity, enzymová syntéza, gelová permeační chromatografie a další separační techniky pro izolaci sacharidů, TLC, HPLC