Zdůvodnění a cíle: Oxidační stres a apoptóza jsou navrhovanými mechanismybuněčného poškození v studiích hepatotoxicity vyvolané cizorodými látkami. Cílem tétopráce bylo nalézt časné signální markery jaterního poškození cizorodými látkamisoustředěním na vybrané antioxidační/oxidační a apoptotické geny. Cílem mé práce dálebylo oslovit vztah mezi obvyklými markery jaterní dysfunkce a mRNA a proteinovouexpresí v modelech hepatotoxicity s D-galaktozamin/lipopolysacharidem a tertbutylhydroperoxidem.Kromě toho, byly vyhodnocené hepatoprotekční možnostiantioxidačních polyfenolů quercetinu a kurkuminu v souvislosti s jejich modulacemioxidačního stresu a apoptotických parametrů v stanovených modelech hapatoxicityzpůsobené cizorodými látkami.Metody: Biochemické markery zkoumající jaterní funkce zahrnují aminotransferázy(ALT, AST) a bilirubin. Meření TBARS a konjugovaných dienů bylo použito k stanoveníperoxidace lipidů. Hladiny katalázy a redukovaného glutathionu byly použity jakoindikátory oxidačního stavu v buňce. Pomocí ‘real-time PCR’ byly analyzovány mRNAexprese inducibilní syntázy oxidu dusnatého (NOS-2), hemoxygenázy-1 (HO-1),superoxiddismutázy (SOD-1), glutathionperoxidázy (Gpx-1), kaspázy 3 (Casp3), BH3interacting domain death agonist (Bid) and Bcl-2 -associated X protein (Bax), a tumornecrosis factor α (TNF- α)mRNAs. Proteinové exprese HO-1 a NOS-2 byly stanovenypomocí metody Western blot. Morfometrické hodnocení hepatocytů použitím světelnéhomikroskopu bylo uděláno na polotenkých segmentech, které byly obarveny toluidinovoumodří. Pro tento účel byl použit Leica IM 500 program pro digitální záznamy a měření.Statistická analýza byla udělána pomocí ANOVA a post hoc Boneffori, Tukey- Kramerporovnávácího testu nebo nepárového T-testu s Welch korekcí.Výsledky: Výsledky této studie nám odhalují časnou aktivaci oxidačního stresu aapoptózy v daných modelech hepatotoxicity, což je vidět z příslušných změn měřenýchparametrů. Hepatoprotekční účinky kurkuminu a quercetinu byly prokázany, přičemžindukce antioxidačního enzymu HO-1 a jejich produkty hrály nejdůležitější cytoprotekčníroli. V případě kurkuminu, paralelně s tímto účinkem, jsme pozorovali i průvodní redukciNOS-2 a TNF-α expressí.Závěr: Porozumění vzájemných regulačních mechanismů testovaných parametrů připoškození hapatocytů by mělo poskytnout důležité stopy k diagnóze a léčbě jaternínemoci. Data vyplývající z této studie připravují cestu pro ty, kteří mají zájem o dalšívýzkum těchto dietních polyfenolů, kurkuminu a quercetinu, neboť dávají přehledpotenciálních cytoprotekčních mechanismů a účinných dávek v daných modelech.
Předběžná náplň práce v anglickém jazyce
Background & Aims: Oxidative stress and apoptosis are proposed mechanisms ofcellular injury in studies of xenobiotic hepatotoxicity. The aim of this work is to findearly signal markers of drug-induced injury of the liver by focusing on selectantioxidant/oxidant and apoptotic genes. As well, to address the relationship betweenconventional liver dysfunction markers and the measured mRNA and protein expressionsin the D-galactosamine/lipopolysaccharide and tert-butylhydroperoxide hepatotoxicitymodels. Furthermore, potential hepatoprotective capabilities of antioxidant polyphenolsquercetin and curcumin were evaluated in relation to its modulation of the oxidativestress and apoptotic parameters in the given xenobiotic hepatotoxicity models.Methods: Biochemical markers testing the hepatic function included aminotransferases(ALT, AST) and bilirubin. Measurements of TBARS and conjugated dienes were used toassess lipoperoxidation. Plasma levels of catalase and reduced glutathione were used asindicators of the oxidative status of the cell. Real time PCR was used to analyse themRNA expressions of the inducible nitric oxide synthase (NOS-2), heme oxygenase-1(HO-1), superoxide dismutase (SOD-1), glutathione peroxidase (Gpx-1), caspase 3(Casp3), BH3 interacting domain death agonist (Bid) and Bcl-2 -associated X protein(Bax), and tumor necrosis factor α (TNF- α)mRNAs. Additionally, the proteinexpressions of HO-1 and NOS-2 were assessed with the use of Western blot method.Morphometric evaluation of hepatocytes at the light microscopical level was done onsemithin epon sections stained by toluidine blue using Leica IM 500 program for digitalrecording and measurements. Statistical analysis was performed using ANOVA and posthoc Boneffori, Tukey- Kramer comparison test or unpaired T-test with Welch correction.Results: Overall, the results of this study have revealed the early activation of oxidativestress and apoptosis in the given hepatotoxic models as seen by the relevant changes inthe tested parameters. Hepatoprotective effects of curcumin and quercetin weredemonstrated, where the induction of the antioxidant enzyme HO-1 and its productsplayed the most important cytoprotective role. In case with curcumin, this effect wasparalleled with the concomitant reduction of NOS-2 and TNF-α expressions.Conclusion: Understanding the mutual regulatory mechanisms of the tested parametersin hepatocyte injury should provide important clues to the diagnosis and treatment ofliver damage. The research data from the present study paves a way for those interestedin further research of these dietary polyphenols, curcumin and quercetin as it gives anoverview of the potential cytoprotective mechanisms and effective doses in the givenmodels.
- zadáno vedoucím/školitelem