Regulace translace v pylu a pylových láčkách

• Název práce v češtině: Regulace translace v pylu a pylových láčkách
• Název v anglickém jazyce: Translation regulation in pollen and pollen tubes
• Klíčová slova: fyziologie rostlin, translace, genová exprese
• Klíčová slova anglicky: plant physiology, translation, gene expression
• Akademický rok vypsání: 2012/2013
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra experimentální biologie rostlin (31-130)
• Vedoucí / školitel: prof. RNDr. David Honys, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 30.10.2012
• Datum zadání: 30.10.2012
• Konzultanti: Said Hafidh

Předběžná náplň práce

Samčí gametofyt představuje vysoce redukovaný haploidní organismus, který dovoluje studovat vývoj a diferenciaci na úrovni jedné haploidní buňky. Správný vývoj a zrání pylu je kontrolováno pomocí řady regulačních mechanismů. Mezi klíčové patří regulace transkripce a regulace translace. Zatímco při transkripci hrají hlavní úlohu transkripční faktory aktivní v různých stádiích vývoje a jimi rozeznávané regulační sekvence, regulace na translační úrovni představuje studium mechanismu skladování mRNA během zrání pylu a její aktivace po vyklíčení pylového zrna. Propojení obou úrovní pak představují transkripční faktory kontrolující expresi a abundanci stavebních kamenů ribosomálních podjednotek, rRNA a ribosomálních bílkovin. Vážným kandidátem na tuto funkci je i transkripční faktor HSFA5-like, který byl funkčně charakterizován v naší laboratoři. V současné době probíhá práce na transkriptomu vyvíjejícího se pylu tabáku, který by měl umožnit identifikaci a následnou isolaci tabákového pylového ortologu proteinu HSFA5-like.
Předmětem této práce bude identifikace a funkční charakterizace proteinů účastnících se regulace translace v pylu a pylových láčkách tabáku a huseníčku. Konkrétně se bude jednat o proteiny funkčně asociované s faktorem HSFA5-like, jejichž předpokládanou funkcí je účast na kontrole transkripce ribosomální RNA či jejích posttranskripčních úpravách. Proteiny budou identifikovány pomocí protein-protein interakčního screenu a jejich interakce s HSFA5-like bude ověřena pomocí dalších metod (např. BiFC). Identifikované a izolované proteiny budou nejprve testovány, zda jsou schopny vázat DNA či RNA. Geny kódující tyto proteiny budou klonovány pomocí Gateway technologie, overexprimovany v E. coli a afinitně purifikovány. Dále bude připravena in vitro UV-cross-linking assay se značenými próbami. Schopnost vázat RNA bude testována pomocí imunoprecipitace, doplněné RT-PCR. Geny kódující tyto RNA-vazebné proteiny exprimované během vývoje pylu budou navíc lokalizovány na buněčné úrovni. Pro tyto účely bude použita GFP in vivo lokalizace a imunodetekce. Pro detekci pomocí GFP budou připraveny fúzní proteiny pomocí Gateway technologie a pyl tabáku bude transientně transformován (particle bombardment, transfekce). Úroveň exprese zkoumaných proteinů bude studována na dvou úrovních. Pro overexpresi bude použita kodující sekvence, která bude klonována a následně exprimována specificky (lat52 promoter) a ektopicky (CaMV 35S promoter). Pro získání knock-down linií budou využity microRNA pod lat52 a NTM19 promotorem. Oba promotory jsou specifické pro samčí gametofyt s odlišnou aktivitou. NTM19 se vyskytuje ve stádiu mikrospor, zatímco lat52 je aktivován ve vegetativní buňce a patří k nejsilnějším promotorům v pozdní fázi vývoje pylu. Odlišnosti ve fenotypu transgenních linií budou sledovány světelným mikroskopem, fluorescenčním mikroskopem a dále elektronovým mikroskopem.