Měření koncentrace dvojmocných iontů v bakteriích pomocí fluorescenčních proteinů

• Název práce v češtině: Měření koncentrace dvojmocných iontů v bakteriích pomocí fluorescenčních proteinů
• Název v anglickém jazyce: Measurement of intracellular concentration of divalent cations in bacteria using fluorescent proteins
• Akademický rok vypsání: 2008/2009
• Typ práce: diplomová práce
• Ústav: Fyzikální ústav UK (32-FUUK)
• Vedoucí / školitel: RNDr. Roman Chaloupka, Ph.D.
• Konzultanti: RNDr. Eva Urbánková, Ph.D.

Zásady pro vypracování

1. Seznámit se s problematikou používání fluorescenčních sond v biovědách, osvojit si základní techniky práce v mikrobiologické laboratoři, kultivaci bakteriálních buněk a základní principy fluorescenční spektroskopie.
2. Vypracovat stručný přehled fluorescenčních sond použitelných pro měření intracellulární koncentrace dvojmocných kovových iontů a zhodnotit jejich použitelnost pro měření v bakteriálních buňkách.
3. Vypracovat literární přehled využití fluorescenčních proteinů při detekci vápníku, případně dalších dvojmocných kovů.
4. Zhodnotit předpokládanou využitelnost dosud známých fluorescenčních proteinů citlivých na vápník pro měření intracelulární koncentrace jiných dvojmocných iontů, jako např. manganu, kadmia či kobaltu.
5. Na základě předchozího bodu vybrat několik fluorescenčních proteinů vhodných pro měření intracelulární koncentrace dvojmocných iontů a otestovat v bakteriích E. coli.
6. Optimalizovat podmínky měření pro nejvhodnější z testovaných fluorescenčních proteinů.

Seznam odborné literatury

1. R.P. Haughland: The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies, Invitrogen Corp. 2005.
2. Miyawaki,A.; Griesbeck,O.; Heim,R.; Tsien,R.Y.: Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999):2135-2140.
3. L.Beranová: Studium funkce bakteriálních transportérů dvojmocných kovů, diplomová práce MFF UK 2007.
4. vybraný soubor původních prací

Předběžná náplň práce

Fluorescenčních sond umožňujících neinvazivní měření vnitrobuněčné koncentrace vápníku existuje v současné době již celá řada, přičemž většina těchto sond reaguje ve větší či menší míře i na přítomnost jiných dvojmocných iontů. Faktorem omezujícím použití těchto sond zejména u bakterií je ovšem vzhledem k neprostupnosti buněčné obálky zajištění dostatečné koncentrace sondy uvnitř buňky. Toto omezení je možno obejít použitím takových fluorescenčních sond, které by byly syntetizovány přímo v cytoplazmě. Pro detekci vápníku byla již několik takových sond vyvinuto, jedná se o různé typy fúzních proteinů spojujících fluorescenční vlastnosti zeleného fluorescenčního proteinu (GFP) s některým z proteinů vážících vápník. Cílem práce bude nejen vypracovat rešerši metod používajících k detekci vápníku fúzní proteiny a zhodnotit jejich předpokládanou využitelnost pro měření vnitrobuněčné koncentrace jiných dvojmocných iontů, jako např. manganu, kadmia či kobaltu, ale rovněž testování použitelnosti vybraných fluorescenčních proteinů v bakteriích E. coli. Hlavním cílem práce je tedy vývoj a optimalizace fluorescenční metody pro měření změn intracelulární koncentrace dvojmocných iontů v bakteriálních buňkách.