XNA (xenobiotické nukleové kyseliny) jsou modifikované umělé analogy biopolymerů ortogonální k přírodním nukleovým kyselinám (DNA nebo RNA). Většinou obsahují modifikovanou cukernou složku, která je činí odolnými vůči štěpení nukleázami a umožňuje unikátní sekundární struktury. Přírodní DNA nebo RNA polymerasy typicky netolerují umělé nukleosidtrifosfáty (XTP), modifikované na cukru i bázi, jako substráty, což výrazně omezuje použití metodik XNA. Za tímto účelem navrhujeme projekt, který si klade za cíl in vitro evoluci upravených XNA polymeras, které by umožnily účinnou enzymovou syntézu modifikovaných XNA z modifikovaných XTP nesoucích portfolio užitečných modifikací. Použijeme nejvýkonnější exonukleázově deficitní varianty polymerázy Thermococcus gorgonarius (Tgo) jako platformu pro tvorbu knihovny mutantů pomocí transposonově řízené mutageneze a cílené mutageneze. S těmito knihovnami potom využijeme zavedené metody pro řízenou evoluci, např. fágový displej nebo výběry založené na emulzi. Konečným a průkopnickým cílem by bylo vyvinout polymerasu schopnou robustní syntézy delších sekvencí XNA s modifikacemi na bázích i na cukrech s použitím úplné sady modifikovaných stavebních bloků XTP se všemi čtyřmi bázemi. Avšak i polymerasa schopná inkorporace několika modifikovaných nukleotidů by byla velmi žádoucí.
Předběžná náplň práce v anglickém jazyce
XNA (xenobiotic nucleic acids) are modified artificial analogues of biopolymers orthogonal to natural nucleic acids (DNA or RNA). They mostly contain modified sugar part that makes them resistant to cleavage by nucleases and enables unique secondary folds. Natural DNA or RNA polymerases typically do not tolerate dual base- and sugar-modified nucleoside triphosphates (XTPs) as substrates which seriously limits the application of the XNA methodology. To this end, we propose a project that aims at the in vitro evolution of engineered XNA polymerases to enable efficient enzymatic synthesis of base-modified XNAs from modified XTPs bearing a portfolio of useful modifications. We will use best performing exonuclease-deficient Thermococcus gorgonarius (Tgo) polymerase variants as a platform for mutant library generation using transposon-directed mutagenesis and targeted mutagenesis. Having the library in hands, we will adopt established methods for directed evolution, e.g. phage display or emulsion-based selections. The ultimate and groundbreaking goal would be to develop a polymerase capable of robust synthesis of longer sequences of dual base- and sugar-modified XNA using full set of all-four-base-modified XTP building blocks. However, even a polymerase capable of incorporation of several base-modified nucleotides would be very desirable.
