Vliv indukovaného odstranění bazálních podjednotek komplexu exocyst na jeho funkci při regulaci buněčné sekrece u rostlin

• Název práce v češtině: Vliv indukovaného odstranění bazálních podjednotek komplexu exocyst na jeho funkci při regulaci buněčné sekrece u rostlin
• Název v anglickém jazyce: Induced depletions of core subunits of the exocyst tethering complex and their impact on the function of the complex in plant cells
• Akademický rok vypsání: 2022/2023
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra biochemie (31-250)
• Vedoucí / školitel: prof. RNDr. Helena Ryšlavá, CSc.
• Konzultanti: Mgr. Lukáš Synek, Ph.D.

Předběžná náplň práce

Exocyst je evolučně konzervovaný poutací komplex podílející se na regulaci sekreční dráhy v eukaryotických buňkách. Exocyst jakožto efektor malých GTPáz významně přispívá ke správnému cílení sekrečních váčků do míst intenzivní exocytózy na plazmatické membráně na základě svých interakcí se specifickými fosfolipidy. Exocyst se skládá z osmi podjednotek: SEC3, SEC5, SEC6, SEC8, SEC10, SEC15, EXO70 a EXO84. V rostlinách je většina genů pro podjednotky exocystu duplikována, přičemž tyto genové paralogy obvykle získaly dodatečné či specifické funkce. Mutace v těchto duplikovaných podjednotkách nejsou letální, ale vedou k mírnému postižení rostlin (např. menší vzrůst, snížená plodnost, krátké pylové láčky). Naproti tomu mutace v neduplikovaných genech, SEC6 a SEC8, jsou letální. SEC10 představuje zvláštní případ, protože byl duplikován velmi nedávno, oba paralogy jsou tudíž téměř identické a kódované proteiny mají stejné vlastnosti. Jediným přístupem, jak studovat ztrátu funkce těchto podjednotek exocystu, je jejich indukované dočasné odstranění.
Student připraví konstrukty pro indukovatelnou expresi ami-RNA cílených proti SEC6 nebo oběma SEC10 genům, které zablokují expresi SEC6 a SEC10 v buňkách a následně ztrátu odpovídajících podjednotek. Po vnesení konstruktů do genomu Arabidopsis thaliana bude farmakologicky indukována exprese ami-RNA a poté analyzováno sestavování komplexu exocyst, schopnost exocystu vázat fosfolipidy plazmatické membrány, interakce exocystu s asociovanými proteiny a dopad na morfologii buňky.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

The exocyst is an evolutionary-conserved tethering complex engaged in the regulation of the secretory pathway in eukaryotic cells. As an effector of small GTPases the exocyst critically contributes to proper targeting of secretory vesicles to the sites of intensive exocytosis at the plasma membrane based on interactions with specific phospholipids. The exocyst consists of eight subunits SEC3, SEC5, SEC6, SEC8, SEC10, SEC15, EXO70, and EXO84. In plants, many of the exocyst genes have been duplicated, and these paralogous genes usually acquired specific additional functions. Therefore, a mutation in one paralog is not lethal but rather generates a mild mutant phenotype (e.g. low height, reduced fertility, short pollen tubes). In contrast, mutations in the single copy genes, SEC6 and SEC8, are lethal. SEC10 represents a special case, because it has been duplicated very recently, both paralogs are nearly identical, and corresponding proteins provide fully redundant functions. In order to explore disfunction of these exocyst subunits, their induced temporary depletion is the only convenient approach.
The student will prepare constructs for inducible expression of ami-RNAs targeted against SEC6 or the two SEC10 genes, which will cause a degradation of SEC6 and SEC10 mRNA transcripts and subsequently a depletion of corresponding proteins in plant cells. After integration of the constructs to the genome of Arabidopsis thaliana, the expression of ami-RNAs will be pharmacologically induced. The assembly of the exocyst complex, the exocyst capacity to bind plasma-membrane phospholipids, the exocyst interaction with associated proteins, and the general impact on the cell morphology will be analyzed. The student will get knowledge of molecular-biological and biochemical methods such as gene cloning, protein-protein interactions assays, lipid-binding assays, molecular dynamics modelling, microbiological methods, and fluorescent microscopy.