Substrate specificity, mechanism and activity regulation of the rhomboid family intramembrane proteases

• Název práce v češtině: Substrátová specifita, mechanismus a regulace aktivity intramembránových proteas z rodiny rhomboidů
• Název v anglickém jazyce: Substrate specificity, mechanism and activity regulation of the rhomboid family intramembrane proteases
• Klíčová slova: membránový protein, intramembránová proteasa, rhomboid, substrátová specifita, mechanismus, struktura, enzymologie
• Klíčová slova anglicky: membrane protein, intramembrane protease, rhomboid, substrate specificity, mechanism, structure, enzymology
• Akademický rok vypsání: 2020/2021
• Typ práce: rigorózní práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Katedra biochemie (31-250)
• Řešitel: skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 22.09.2021
• Datum zadání: 22.09.2021
• Datum potvrzení stud. oddělením: 02.11.2021
• Datum odevzdání elektronické podoby: 22.09.2021
• Datum proběhlé obhajoby: 01.12.2021

Předběžná náplň práce

Tématem disertační práce Mgr. Škerle bude substrátová specifita a mechanismus intramembránových proteas z rodiny rhomboidů a jejich biologické funkce ve vybraných bakteriích. Po metodické stránce bude projekt zahrnovat klonování DNA, cílenou mutagenezi, expresi rekombinantních membránových proteinů v bakteriích a jejich purifikaci, enzymovou kinetiku, imunochemickou analýzu proteinů, bioinformatiku, bakteriální genetiku, buněčnou biologii a fyziologii. Budeme klást důraz rovněž na rozvoj schopnosti kritického hodnocení odborné literatury, jakož i na komunikaci a presentaci výsledků formou písemnou i ústní v češtině i angličtině. Zvládnutí výše uvedeného vybaví Mgr. Škerleho odbornými i přenositelnými dovednostmi a bude pevným základem pro jeho další zapojení do nezávislé vědecké práce v akademickém nebo průmyslovém prostředí, dle jeho výběru.

Dílčí cíle práce:
I. Vytvoření knihovny potenciálních substrátů z genomu Escherichia coli.
II. Identifikace repertoáru substrátů rhomboidů z E.coli (a dalších vybraných rhomboidů zastupujících hlavní fylogenetické klastry) pomocí testování knihovny in vitro.
III. Enzymologická charakterisace nalezených substrátů a analysa specifity příslušných rhomboidů in vitro a in vivo.
IV. Zjištění potenciálního regulačního vlivu konservovaných extramembránových domén rhomboidů na rozpoznávání a štěpení substrátů a případné interakce s jinými proteinovými efektory.
V. Identifikace endogenních substrátů rhomboidů E.coli.
VI. Vývoj a aplikace metod identifikace substrátů rhomboidů pomocí kvantitativní proteomiky (substráty identifikované v bodě V poslouží jako esenciální pozitivní kontroly).
VII. Genetická a biochemická analysa biologických funkcí endogenních substrátů a příslušných rhomboidů v E.coli a případně příbuzných druzích bakterií kódujících orthologní rhomboidy.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

The PhD project of Mgr. Skerle will focus on substrate specificity and mechanism of intramembrane proteases of the rhomboid family and their biological roles in selected bacterial species. The experimental approaches will involve recombinant DNA cloning, site-directed mutagenesis, over-expression and purification of recombinant proteins, enzyme kinetics, immunochemical analysis of proteins, bioinformatics, bacterial genetics, and cell biology and physiology. Apart from the experimental work, ample training will be provided in critical reading of scientific literature, and communication and data presentation in written and spoken form in Czech and English. This will together equipp Mgr. Skerle with both specific scientific and transferrable skills that will constitute a firm basis for his future carrier in research, in academia or in industry.

Experimental aims of the project:
I. Generation of the library of potential substrates from Escherichia coli genome.
II. Identification of substrate repertpoires of E.coli rhomboids (and of other selected rhomboids representing selected phylogenetic clusters) by biochemical screening of the library in vitro.
III. Enzymological characterisation of the identified substrates and analysis of substrate specificity of the relevant rhomboids in vitro a in vivo.
IV. Analysis of the role of the conserved extramembrane domains of rhomboids in substrate recognition and cleavage, or their possible interaction with other protein factors.
V. Identification of the endogenous substrates of E.coli rhomboids.
VI. Development and application of substrate identification methods exploiting quantitative proteomics (the substrates identified under heading V. will serve as positive controls).
VII. Genetic and biochemical analysis of the biological functions of the endogenous substrates and the respective rhomboids in E.coli and related bacterial species encoding orthologous genes.