Analýza aktivního místa rutinosidasy z Aspergillus niger a jeho mutageneze
| Název práce v češtině: | Analýza aktivního místa rutinosidasy z Aspergillus niger a jeho mutageneze |
|---|---|
| Název v anglickém jazyce: | Rutinosidase from Aspergillus niger – analysis of active site and its mutagenesis |
| Klíčová slova: | diglykosidasa; isokvercetin; mutageneze; Pichia pastoris; rutin; substrátová specifita; rutinosidasa |
| Klíčová slova anglicky: | diglycosidase; isoquercetin; mutagenesis; Pichia pastoris; rutin; substrate specificity; rutinosidase |
| Akademický rok vypsání: | 2021/2022 |
| Typ práce: | diplomová práce |
| Jazyk práce: | čeština |
| Ústav: | Katedra analytické chemie (31-230) |
| Vedoucí / školitel: | doc. RNDr. Pavla Bojarová, Ph.D. |
| Řešitel: | skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd. |
| Datum přihlášení: | 05.11.2021 |
| Datum zadání: | 12.12.2021 |
| Datum potvrzení stud. oddělením: | 12.12.2021 |
| Datum odevzdání elektronické podoby: | 17.05.2023 |
| Datum proběhlé obhajoby: | 29.05.2023 |
| Oponenti: | RNDr. Mgr. Andrea Palyzová, Ph.D. |
| Konzultanti: | prof. RNDr. Zuzana Bosáková, CSc. |
| Seznam odborné literatury |
| P. Pachl, J. Kapešová, J. Brynda, L. Biedermannová, H. Pelantová, P. Bojarová, V. Křen, P. Řezáčová, M. Kotik: Rutinosidase from Aspergillus niger: Crystal structure and insight into the enzymatic activity. FEBS J. 2020,287, 3315-3327.
D. Šimčíková, M. Kotik, L. Weignerová, P. Halada, H. Pelantová, K. Adamcová, V. Křen: α-L-Rhamnosyl-β-D-glucosidase (rutinosidase) from Aspergillus niger: Characterization and synthetic potential of a novel diglycosidase. Adv. Synth. Catal. 2015,357, 107-117. L. S. Mazzaferro, G. Weiz, L. Braun, M. Kotik, H. Pelantová, V. Křen, J. D. Breccia: Enzyme-mediated transglycosylation of rutinose (6-O-α-L-rhamnosyl-D-glucose) to phenolic compounds by a diglycosidase from Acremonium sp. DSM 24697. Biotechnol. Appl. Biochem. 2019,66, 53-58. M. Kotik, H. Javůrková, K. Brodsky, H. Pelantová: Two fungal flavonoid-specific glucosidases/rutinosidases for rutin hydrolysis and rutinoside synthesis under homogeneous and heterogeneous reaction conditions. AMB Expr 2021, 11, 136. K. Brodsky, M. Kutý, H. Pelantová, J. Cvačka, M. Rebroš, M. Kotik, I. Kutá-Smatanová, V. Křen, P. Bojarová: Dual Substrate Specificity of the Rutinosidase from Aspergillus niger and the Role of Its Substrate Tunnel. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5671. M. Kotik, K. Brodsky, P. Halada, H. Javůrková, H. Pelantová, D. Konvalinková, P. Bojarová, V. Kře: Access to both anomers of rutinosyl azide using wild-type rutinosidase and its catalytic nucleophile mutant. Catal. Commun. 2021, 149, 106193. |
| Předběžná náplň práce |
| Rutinosidasa z A. niger je extracelulární glykosidasa (CAZY GH5), která má duální substrátovou specifitu k rutinu a isokvercetinu. Funguje tedy jako β-glukosidasa s širokou substrátovou specifitou. Tato glykosidasa má velmi vysokou transglykosylační aktivitu s širokým akceptorovým spektrem (glykosyluje alifatické alkoholy, fenoly a dokonce i karboxylové kyseliny) s vysokými syntetickými výtěžky. Ze známé krystalové struktury vyplývá, že enzym má specifické vazebné místo pro aglykon (kvercetin) a dále je ve struktuře tunel, který přivádí k aktivnímu centru akceptor. Oba tyto rysy jsou u glykosidas zcela unikátní a zaslouží podobné prozkoumání. Pomocí substrátů modifikovaných na aglykonu (kvercetin) bude možné zmapovat podrobně vazebné místo aglykonu (např. za použití komerčně dostupnéých glukopyranosidů isorhamnetinu, kaempferolu a dalších), a též vazebné místo glykanu pomocí acylderivátů isokvercetinu (k dispozici na školicím pracovišti). Na základě získaných informací a molekulárního modelování (provádí spolupracující pracoviště) bude zvolena a provedena bodová mutace v aktivním místě enzymu pro prostudování substrátové a akceptorové specifity enzymu.
Cílem této práce je heterologně exprimovat rekombinantní nativní rutinosidasu z A. niger v Pichia pastoris a alespoň jednu její mutantní variantu navrženou podle výsledků studia substrátové specifity s modifikovanými substráty a molekulárního modelování. Na základě získaných výsledků pak detailně analyzovat vliv provedené mutace na vlastnosti enzymu. Cíle práce: · Exprese nativní a mutantní rutinosidasy z A. niger z plasmidů připravených v laboratoři a purifikace těchto enzymů afinitní chromatografií · Detailní analýza substrátové specifity nativní a rekombinantní rutinosidasy z A. niger pomocí modifikovaných substrátů (komerční nebo jsou k dispozici na školicím pracovišti), proměření kinetických parametrů vybraných substrátů · Cílená mutageneze rutinosidasy, její biochemická analýza a vyhodnocení vlivu mutace. Metody: práce s DNA, HPLC a LC-MS, transformace a kultivace Pichia pastoris, chromatografická purifikace a charakterizace enzymů, analýza substrátové specifity enzymů |