Pokročilé metody stanovení lektin-sacharidové interakce

• Název práce v češtině: Pokročilé metody stanovení lektin-sacharidové interakce
• Název v anglickém jazyce: Advanced methods of assaying lectin-carbohydrate interaction
• Klíčová slova: BLI; ELISA; galektin; biotinylace; ITC
• Klíčová slova anglicky: BLI; ELISA; galectin; in vivo biotinylation; ITC
• Akademický rok vypsání: 2020/2021
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra analytické chemie (31-230)
• Vedoucí / školitel: prof. RNDr. Zuzana Bosáková, CSc.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 19.10.2020
• Datum zadání: 19.10.2020
• Datum odevzdání elektronické podoby: 10.05.2022
• Datum proběhlé obhajoby: 27.05.2022
• Oponenti: RNDr. Jiří Pavlíček, Ph.D.
• Konzultanti: doc. RNDr. Pavla Bojarová, Ph.D.

Předběžná náplň práce

Kvantifikace a charakterizace interakcí mezi lektinem a sacharidem je komplexní problematikou, kterou lze studovat řadou metod. Jedním ze základních požadavků by mělo být minimální zatížení získaných výsledků zvolenými parametry stanovení. Získané zdánlivé hodnoty disociačních konstant lektin-sacharidového komplexu by se měly tedy co nejvíce blížit skutečné objektivní hodnotě K_D. Jedním za základních parametrů je volba stanovení interakce na pevné fázi nebo v roztoku. Isotermální titrační kalorimetrie (Isothermal Titration Calorimetry, ITC) se považuje za referenční metodou v roztoku, jež dává výsledky nejvíce se blížící skutečné hodnotě K_D. Metoda povrchové plasmonové rezonance (Surface Plasmon Resonance, SPR) je metodou stanovení interakce na rozhraní pevné fáze a roztoku, kdy je jeden z interakčních partnerů imobilizován na biosenzoru. Tato technika je vhodná nejen pro sledování interakce v biologických systémech, ale, a v tom je unikátní, i pro studium kinetiky této interakce. Kvalitu měření může však dramaticky ovlivnit metoda imobilizace interakčního partnera na povrch biosenzoru. Při studiu interakcí mezi galektinem-3 a multivalentními glykokonjugáty bylo zjištěno, že galektin-3 nelze imobilizovat na biosenzor prostřednictvím hydrofobní interakce ani za využití histidinové kotvy bez značné ztráty lektinové aktivity. Naopak jako optimální se ukázala cílená imobilizace prostřednictvím specifického peptidu, tzv. „Avi-tag“, nesoucího jednu molekulu biotinu. Disociační konstanty stanovené za použití tohoto systému byly srovnatelné s výsledky naměřené referenční metodou ITC.
Cílem práce je připravit alespoň jeden konstrukt dalšího galektinu nesoucí peptid Avi-tag metodami molekulární biologie a optimalizovat jeho imobilizaci na biosenzor SPR. Využitelnost připraveného konstruktu bude demonstrována na stanovení kinetiky interakcí s vybranými multivalentními ligandy galektinu. Výsledky budou porovnány se stanovením afinity pomocí ITC a diskutovány.