O poměrně unikátním systému lineárních, cytoplasmaticky lokalizovaných dsDNA plasmidů vyskytujících se u některých kvasinkových druhů existují zatím vcelku kusé informace, které jsou postupně, i s přispěním naší pracovní skupiny, doplňovány. V současné době jsou známé informace o transkripci genů kódovaných těmito plasmidy, stejně tak je prostudovaný i jejich transkriptom. Právě studium transkriptomu odhalilo nečekané uspořádání 5´ konců plasmid specifických mRNA. Ukázalo se, že většina těchto mRNA obsahuje na svém 5´ konci několik netemplátově přidaných adenosinových zbytků. Hlavní náplní práce bude studium vlivu těchto netemplátových sekvencí na 5´ koncích mRNA na jejich translaci. Prvním krokem bude konstrukce kvasinkového reportérového plasmidu obsahujícího dva reportérové geny, pravděpodobně dvě různé luciferázy, z nich každá bude pod kontrolou jiného konstitutivního promotoru. Poté bude pomocí 5´RACE-PCR určen transkripční start (TSS) mRNA kódujících tyto luciferázy a souběžně stanovena míra exprese obou reportérů. Následně bude řešitel tohoto projektu pomocí oligonukleotidem řízené mutageneze měnit TSS ve smyslu počtu adenosinových zbytků na 5´ konci reportérových mRNA molekul s následným opětovným stanovením míry exprese daného reportéru a tudíž stanovení vlivu počtu adenosinových zbytků na 5´ konci mRNA molekul na míru exprese. Exprese takto připravených a charakterizovaných konstruktů bude následně stanovena i v kvasinkových kmenech s delecemi jednotlivých složek translačního iniciačního aparátu. Některé z kmenů máme již k dispozici, o jiné požádáme spřátelené laboratoře zabývající se iniciací translace u kvasinek.
- zadáno vedoucím/školitelem