Proteinové interakce translačních iniciačních faktorů 4E

• Název práce v češtině: Proteinové interakce translačních iniciačních faktorů 4E
• Název v anglickém jazyce: Protein interactions of 4E translation initiation factors
• Klíčová slova: iniciace translace; eIF4E; eIF4E2; eIF4E3; mutageneze; eIF4E-BP; buněčná lokalizace; lidské tkáňové kultury; polyzomálální frakcionace
• Klíčová slova anglicky: translation initiation; eIF4E; eIF4E2; eIF4E3, mutagenesis; eIF4E-BP; cellular localization; human cell culture; polysome fractionation
• Akademický rok vypsání: 2019/2020
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
• Vedoucí / školitel: RNDr. Tomáš Mašek, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 08.10.2019
• Datum zadání: 08.10.2019

Předběžná náplň práce

U vyšších eukaryot se vyvinuly paralogické geny kódující translační faktory rodiny 4E. Tyto bílkoviny, ačkoliv jsou velice podobné kanonickému faktoru eIF4E1 na sekvenční úrovni, získaly některé speciální vlastnosti, díky kterým např. regulují preferenční translaci některých mRNA, zprostředkovávají translační inhibici nebo je jejich exprese tkáňově, či vývojově specifická. V lidském genomu můžeme najít vyjma genu pro prototypický eIF4E1 ještě geny pro eIF4E2 (4EHP, II. třída proteinové rodiny) a eIF4E3 (3. třída).
Navržené téma diplomové práce je zaměřeno na místně specifickou mutagenezi vazebných míst pro čepičku a proteiny eIF4G/4-ET/4E-BP v proteinech eIF4E2 a eIF4E3. Naším cílem je zjistit, jaký aminokyselinový motiv je zodpovědný za rozdílnou vazebnou afinitu proteinů 4E k čepičce a výše zmíněným interakčním partnerům. Téma následně zahrnuje biochemickou a mikroskopickou charakterizaci mutantních verzí proteinů. Student se naučí především následující metody: mutagenní PCR a molekulární klonování, purifikace a imunoprecipitace proteinů, western blot, mikroskopie, práce s lidskými tkáňovými kulturami a transfekce buněk.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Translation initiation exerts a tight control over the last step of gene expression. Higher eukaryotes evolved several eIF4E paralogues that encode distinctly featured proteins, many of which are involved in the preferential translation of specific mRNAs or are tissue- and developmental stage- specific. Besides eIF4E1, the members of class 2 (eIF4E2, 4EHP) and class 3 (eIF4E3) of the eIF4E protein family are encoded by the human genome. Both eIF4E2 and eIF4E3 are capable of cap-binding, albeit with a 40-fold lower affinity compared to eIF4E1 and they also differ in their ability to bind eIF4G and 4E-BPs.
The proposed MSc thesis will be focused on the site directed mutagenesis of cap- and eIF4G/4-ET/4E-BPs-binding sites in human eIF4E2 and eIF4E3 proteins with the aim to delineate amino acids sequence which is responsible for different binding affinities of eIF4E proteins. The topic will include biochemical and microscopic evaluation of mutated protein variants. The student will mainly learn and use the following methodical approaches: mutagenic PCR and molecular cloning, protein purification, immunoprecipitation, western blot, microscopy, human tissue culture propagation and cell culture transfection.