Role of fibroblasts in wound healing and cancer

• Název práce v češtině: Role fibroblastů při hojení ran a rakovině
• Název v anglickém jazyce: Role of fibroblasts in wound healing and cancer
• Klíčová slova: nádorové mikroprostředí, nádorově asociované fibroblasty, melanom, cytokiny, hojení ran, novorozené fibroblast
• Klíčová slova anglicky: tumor microenvironment, cancer-associated fibroblasts, melanoma, cytokines, wound healing, newborn fibroblast
• Akademický rok vypsání: 2014/2015
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Anatomický ústav 1. LF UK (11-00110)
• Vedoucí / školitel: prof. MUDr. Karel Smetana, DrSc.
• Řešitel: skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 03.10.2014
• Datum zadání: 03.10.2014
• Datum potvrzení stud. oddělením: 03.10.2014
• Datum a čas obhajoby: 14.09.2021 14:00
• Místo konání obhajoby: seminární místnost č. 4 Ústavu histologie a embryologie 1. LF UK
• Datum odevzdání elektronické podoby: 05.05.2021
• Datum proběhlé obhajoby: 14.09.2021
• Předmět: Obhajoba dizertační práce (B90002)
• Oponenti: prof. RNDr. Michal Masařík, Ph.D.

Předběžná náplň práce

Fibroblasty jsou stromální buňky, které jsou rozšířené v celém lidském těle. Často se vyskytují v neaktivním stavu a k jejich aktivaci dochází až při remodelaci tkáně. Aktivované fibroblasty produkují extracelulární matrix, mají prozánětlivé a kontraktilní vlastnosti, což jsou klíčové momenty v hojení tkání. Na druhou stranu je přítomnost aktivovaných fibroblastů jedním z typických znaků nádorového bujení. Cílem této práce je porovnání rozdílů mezi novorozeneckými a dospělými fibroblasty a keratinocyty ve vztahu k „bezjizevnatému“ hojení, k původu nádorově asociovaných fibroblastů a vlivu fibroblastů na invazivitu melanomu.
Klinické zkušenosti ukazují, že se u novorozenců hojí rány téměř bez jizvení. Abychom lépe porozuměli mechanizmům, které k tomuto hojení přispívají, zaměřili jsme se na rozdíly mezi novorozeneckými a dospělými fibroblasty a keratinocyty, kožními buňkami, které jsou zásadní pro hojivý proces. Srovnání expresního profilu novorozeneckých a dospělých fibroblastů ukázalo, že jsou rozdílně regulovány geny, které se vztahují k akutní fázi zánětlivé odpovědi a organizaci extracelulární matrix, což úzce souvisí s procesem hojení. Také jsme zjistili, že novorozenecké fibroblasty vykazují vyšší diferenciační potenciál, exprimují znaky nízké diferenciace a pluripotence a také častěji produkují hladký svalový aktin a (α-SMA).
Fibroblasty, které produkují α-SMA, jsou nazývány myofibroblasty a jsou hlavními producenty extracelulární matrix a klíčovými hráči v hojení ran. Signalizační dráha transformujícího růstového faktoru beta (TGF-β) spouští expresi -SMA ve fibroblastech. Zjistili jsme, že novorozenecké fibroblasty vykazují ve srovnání s dospělými zvýšenou expresi transkriptu TGF-β2 and TGF-β3 a naopak sníženou expresi receptoru II transformujícího růstového faktoru (TGF-R2).
Navíc může být exprese α-SMA zvýšena jak u dospělých, tak i novorozeneckých fibroblastů jejich kokultivací s novorozeneckými keratinocyty. To ukazuje na (nebo podtrhuje) význam vzájemné komunikace mezi fibroblasty a epitelovými buňkami. Novorozenecké keratinocyty exprimují (produkují) keratin-8, -14 a -19, které jsou charakteristické pro nízce diferencované buňky. Tento expresní profil keratinů připomíná profil nádorových epitelových buněk.
Ve druhé části této práce jsme zkoumali roli fibroblastů v invazivitě melanomů. Sledovali jsme, jak kondiciovaná média z lidských fibroblastů a nádorově-asociovaných fibroblastů (CAFs) ovlivňují in vitro invazivitu buněk lidské melanomové linie. Melanomové buňky vykazovaly vyšší invazivitu, jestliže byly kultivovány v médiu kondiciovaném nádorově asociovanými fibroblasty. Kokultivace nádorově asociovaných fibroblastů s melanomovými buňkami vyvolávala zvýšenou sekreci IL-6 u fibroblastů a IL-8 u melanomových buněk, avšak současná blokace IL-6 a IL-8 dokázala zvrátit zvýšenou invazivitu melanocytů, vyvolanou přítomností fibroblastů. Vysoké hladiny IL-6 a IL-8 byly také stanoveny v sérech pacientů s melanomem.
Vzhledem k tomu, že původ nádorově asociovaných fibroblastů je nejasný, soustředili jsme se na možnost, že mohou vznikat z buněk karcinomu epitelo-mezenchymální tranzicí. Jestliže byly lidské karcinomové buňky inokulovány do nu/nu myší, vytvořily nádory, které obsahovaly dobře strukturované stroma s nádorově asociovanými fibroblasty produkujícími hladký svalový aktin. Zjistili jsme, že tyto buňky nepocházely z xenotransplantátu, ale že byly myšího, tedy hostitelského původu.
Získané výsledky uvedené v této dizertační práci potvrzují, že fibroblasty jsou dynamickou, heterogenní buněčnou populací, která hraje klíčovou roli jak v hojení ran, tak i při tvorbě nádoru.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Fibroblasts are stromal cells ubiquitously present in the human body. They often appear in a quiescent state and can become activated in response to tissue remodeling signals. Activated fibroblasts acquire biosynthetic, pro-inflammatory and contractile properties, key functions for wound healing. In addition, the presence of permanently activated fibroblasts is one of the hallmarks of cancer. The purpose of this work is to investigate the differences between newborn and adult fibroblasts and keratinocytes in their implication in scarless wound healing, the origin of cancer associated fibroblasts (CAF)s and the influence of fibroblasts in melanoma invasion.
Evidence suggests that wounds heal almost without scar in newborns. To understand the mechanisms that contribute to scarless wound healing we focused on the differences between newborn and adult fibroblasts and keratinocytes, which are cells present in human skin and participating in wound healing process. A comparison of the expression profile between newborn and adult fibroblasts showed differentially regulated genes related to the acute phase of the inflammatory response and ECM organization, traits involved in wound healing. We also found that newborn fibroblast showed higher differentiation potential, exhibited markers of pluripotency and poor differentiation and expressed smooth muscle actin α (α-SMA) more frequently.
α-SMA expressing fibroblasts are called myofibroblasts and they are the main producers of ECM, and are key players in wound healing. Transforming growth factor beta (TGF-β) signaling pathway triggers the expression of -SMA in fibroblasts. We noticed that newborn fibroblasts showed an upregulation of transcripts for TGF-β2 and TGF-β3, and downregulation of the transforming growth factor receptor II (TGF-R2) compared to adult fibroblasts.
In addition, the expression of α-SMA in both adult and newborn fibroblasts can be increased in coculture with newborn keratinocytes, indicating the importance of the crosstalk of fibroblasts with epithelial cells. The newborn keratinocytes showed expression of keratins (K)- 8, -14 and -19, markers of poor differentiation. This reminds the keratin expression profile of malignant cells.
In the second part of this work we examined the role of fibroblasts in melanoma invasion. We studied how the secretome from human fibroblasts and CAFs affected human melanoma cell line invasiveness in vitro. Melanoma cells appeared more invasive when cultivated in conditioned media from CAFs. Cocultivation of CAFs with melanoma cells induced secretion of interleukin 6 (IL)-6 in fibroblasts and IL-8 in melanoma cells. High levels of IL-6 and IL-8 have been observed in melanoma patient serum. Moreover simultaneous blocking of IL-6 and IL-8 reversed fibroblasts induced melanoma cell invasiveness.
Since the source of CAFs is unclear we investigated the possibility that they can originate from cancer cells through epithelial-to-mesenchymal transition. For this purpose human cancer cells were grafted to nu/nu mice. Tumors were formed, they contained a well structured stroma containing typical smooth muscle actin cancer-associated fibroblasts. We observed that these cells did not originate from the xenografted cells, instead they were from the host origin.
Findings summarized in this thesis suggest that fibroblasts are a dynamic heterogeneous cells population and are key players in both wound healing and cancer.