3D superrezoluční fluorescenční fotoaktivační lokalizační mikroskopie mitochondrií

• Název v anglickém jazyce: 3D fluorescent superresolution photoactivation localization microscopy of mitochondria
• Klíčová slova: Fluorescenční mikroskopie, 3D zobrazení s 30 nm rozlišením, BiplaneFPALM mikroskop, počítačové zpracování dat, 3D PALM, 3D dSTORM
• Klíčová slova anglicky: 3D fluorescence photoactivated localization microscopy, Biplane FPALM microscope, data processing3D PALM, 3D dSTORM
• Akademický rok vypsání: 2016/2017
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. (32-FGUAV)
• Vedoucí / školitel: RNDr. Petr Ježek, DrSc.

Zásady pro vypracování

Bude upřesněno, podrobnější informace viz mail [e-mail]

Seznam odborné literatury

1. M. Fernández-Suárez, Y.T. Ting. Fluorescent probes for superresolution imaging in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 9 (2008) 929-943.
2. S.W. Hell, Far-field optical nanoscopy. Science 316 (2007) 1153-1158.
3. A. Egner, C. Geisler, C. von Middendorff, H. Bock, D. Wenzel, R. Medda, M. Andresen, A.C. Stiel, S. Jakobs, C. Eggeling, A. Schönle, S.W. Hell, Fluorescence nanoscopy in whole cells by asynchronous localization of photoswitching emitters, Biophys. J. 93 (2007) 3285-3290.
4. K.I. Willig, B. Harke, R. Medda, S.W. Hell, STED microscopy with continuous wave beams, Nat. Methods 4 (2007) 915-918.
5. E. Betzig, G.H. Patterson, R. Sougrat, O.W. Lindwasser, S. Olenych, J.S. Bonifacino, M.W. Davidson, J. Lippincott-Schwartz, H.F. Hess, Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution, Science 313 (2006) 1642-1645.
6. S.T. Hess, T.P.K. Girirajan, M.D. Mason, Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy, Biophys. J. 91 (2006) 4258-4272.
7. H. Shroff, C.G. Galbraith, J.A. Galbraith, H. White, J. Gillette, S. Olenych, M.W. Davidson, E. Betzig, Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (2007) 20308–20313.
8. B. Hein, K.I. Willig, S.W. Hell, Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 (2008) 14271–14276.
9. R. Schmidt, C.A. Wurm, S. Jakobs, J. Engelhardt, A.Egner, S.W. Hell, Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells, Nat. Methods 5 (2008), 539-544.
10. M.F. Juette, T.J. Gould, M.D. Lessard, M.J. Mlodzianoski, B.S. Nagpure, B.T. Bennett, S.T. Hess, J. Bewersdorf, 3D sub-100 nm resolution by biplane fluorescence photoactivation localization microscopy, Nat. Methods 5 (2008), 527-529.
11. S.W. Hell, E.H.K. Stelzer, Properties of a 4Pi-confocal fluorescence microscope, J. Opt. Soc. Am. A. 9 (1992) 2159-2166.
12. S.W. Hell, E.H.K. Stelzer, Fundamental improvement of resolution with a 4Pi-confocal fluorescence microscope using two-photon excitation, Opt. Commun. 93 (1992) 277-282.
13. K. Bahlmann, S. Jakobs, S.W. Hell, 4Pi-confocal microscopy of live cells, Ultramicroscopy 87 (2001) 155-164.
14. H. Gugel, J. Bewersdorf, S.Jakobs, J. Engelhardt, R. Storz, S.W. Hell, Cooperative 4Pi excitation and detection yields sevenfold sharper optical sections in live-cell microscopy, Biophys. J. 87 (2004) 4146-4152.
15. J.N. Spelbrink, Functional organization of mammalian mitochondrial DNA in nucleoids: History, recent developments, and future challenges, IUBMB Life 62 (2010) 19-32.
16. A. Dlasková, T. Špaček, J. Šantorová, L. Plecitá-Hlavatá, Z. Berková, F. Saudek, M. Lessard, J. Bewersdorf, P. Ježek, 4Pi microscopy reveals an impaired three-dimensional mitochondrial network of pancreatic islet -cells, an experimental model of type-2 diabetes. Biochim. Biophys. Acta (2010), Feb 6. [Epub ahead of print].
17. L.J. Wong, Pathogenic mitochondrial DNA mutations in protein-coding genes, Muscle Nerve 36 (2007) 279-93.
18. S.I. Zhadanov, E.Y. Grechanina, Y.B. Grechanina, V.A. Gusar, N.P. Fedoseeva, S. Lebon, A. Munnich, T.G. Schurr, Fatal manifestation of a de novo ND5 mutation: Insights into the pathogenetic mechanisms of mtDNA ND5 gene defects. Mitochondrion 7 (2007) 260-266.
19. P. Amati-Bonneau, et al., OPA1 mutations induce mitochondrial DNA instability and optic atrophy 'plus' phenotypes. Brain 131 (2008) 338-351.
20. E.A. Schon, R.W. Gilkerson, Functional complementation of mitochondrial DNAs:Mobilizing mitochondrial genetics against dysfunction. Biochim. Biophys. Acta 1800 (2010) 245-249.
21. R.W. Gilkerson, E.A. Schon, E. Hernandez, M.M. Davidson, J. Cell Biol. 181 (2008) 1117–1128.
22. I.J. Holt, J. He, C.C. Mao, J.D. Boyd-Kirkup, P. Martinsson, H. Sembongi, A. Reyes, J.N. Spelbrink, Mammalian mitochondrial nucleoids: organizing an independently minded genome, Mitochondrion 7 (2007) 311-321.
23. B.A. Kaufman, N. Durisic, J.M. Mativetsky, S. Costantino, M.A. Hanckock, P. Grutter, E.A. Shoubridge, The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures, Mol. Biol. Cell 18 (2007), 3225-3236.
24. K. Maniura-Weber, S. Goffart, H.L. Garstka, J. Montoya, R.J. Wiesner, Transient overexpression of mitochondrial transcription factor A (TFAM) is sufficient to stimulate mitochondrial DNA transcription, but not sufficient to increase mtDNA copy number in cultured cells, Nucl. Ac. Res. 32 (2004) 6015-6027.
25. L.M. Cree, D.C. Samuels, S. Lopes, H.K. Rajasimha, P. Wonnapinij, J.R. Mann, H.-H.M. Dahl, P.F. Chinnery, A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes, Nat. Genet. 40 (2008) 249-254.
26. A. Dlasková, L. Hlavatá, P. Ježek, Oxidative stress caused by blocking of mitochondrial Complex I H+ pumping as a link in aging/disease vicious cycle. Int. J. Biochem. & Cell Biol. 40 (2008) 1792-1805.
27. L. Plecitá-Hlavatá, M. Lessard, J. Šantorová, J. Bewersdorf, P. Ježek, Mitochondrial oxidative phosphorylation and energetic status are reflected by morphology of mitochondrial network in INS-1E and HEP-G2 cells viewed by 4Pi microscopy, Biochim. Biophys. Acta 1777 (2008) 834 -846.
28. A. Dance. Tricking the Light-Fantastic. Techniques for achieving super-resolution imaging. The Scientist 2010 Vol. 24 (11) p69.
29. L. Alán, J. Zelenka, J. Ježek, A. Dlasková, P. Ježek. Fluorescent in situ hybridization of mitochondrial DNA and RNA. Acta Biochim Pol. 57 (2010) 403-8.
30. J. Zelenka, Alán L, Jabůrek M, Ježek P. Import of desired nucleic acid sequences using addressing motif of mitochondrial ribosomal 5S-rRNA for fluorescent in vivo hybridization of mitochondrial DNA and RNA. J Bioenerg Biomembr. 2014 Feb 23

Předběžná náplň práce

Měření na BiplaneFPALM mikroskopu pro 3D fluorescenční fotoaktivační lokalizační mikroskopii (FPALM), kdy je postupně aktivována, lokalizována a zhášena subpopulace fotokonvertibilních fluorescenčních proteinů a z výsledné agregátní informace poloh jednotlivých molekul je sestaven obraz s vysokým rozlišením (~30 nm) budeme soustřeďovat na studie sítě mitochondrií v buňce a klastrů mitochondriální DNA (mtDNA) uvnitř této sítě. Je třeba vylepšit snímání a přesnost lokalizace při dvoubarevném značení konjugáty fotokonvertibilních fluorescenčních proteinů či 3D imunocytochemií, např. rozšířením stávajících tzv. "drift correction" algoritmů. Studie 3D struktury mitochondriální sítě , mikrotubulů cytoskeletonu, mtDNA s proteiny, tzv. nukleoidů. Mt nukleoidy v klidovém, transkripčním a replikačním stavu ve vztahu k mitochondriím, cytoskeletonu a mt ribozomům. Studium spojení mitochondrií s endoplasmatickým retikulem. Spolupráce s prof. J. Bewersdorfem, Dept. Cell. Biol. Yale Univ. na 4Pi&PALM mikroskopii. Práce spojuje fyziku s molekulární fyziologií. Schopnost pracovat s programy na zpracování dat a vytváření obrázků, včetně programování a vývoje nových modulů. Předpokládané znalosti na úrovni ukončeného magisterského studia v oboru biofyzika. Viz: Mlodzianoski, M.J. Schreiner, J.M. Callahan, S.P. Smolková, K. Dlasková, A., Šantorová, J., Ježek, P., Bewersdorf, J.: Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy. Opt. Express. 19, (2011), 15009-15019