Onkogenní promotor c-myc jako cíl pro nový typ heterocyklických dikationtů stabilizujících G-kvadruplex.

• Název práce v češtině: Onkogenní promotor c-myc jako cíl pro nový typ heterocyklických dikationtů stabilizujících G-kvadruplex.
• Název v anglickém jazyce: The promoter of c-myc oncogene as a target for a novel type of heterocyclic cations stabilizing G-quadruplex.
• Klíčová slova: G-kvadruplex, G-kvadruplexové ligandy, luciferázová reportérová esej, onkogenní promotory, c-MYC
• Klíčová slova anglicky: G-quadruplex, G-quadruplex ligands, luciferase reporter assay, oncogene promoters, c-MYC
• Akademický rok vypsání: 2012/2013
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra buněčné biologie (31-151)
• Vedoucí / školitel: Mgr. Martina Šmídková
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 26.10.2012
• Datum zadání: 30.01.2013
• Datum odevzdání elektronické podoby: 14.08.2015
• Datum proběhlé obhajoby: 16.09.2015
• Oponenti: Mgr. Hana Remešová, Ph.D.

Předběžná náplň práce

Tvorba G-kvadruplexových struktur hraje významnou roli v několika buněčných procesech jako je transkripce, translace a replikace. Tyto struktury se podílejí na regulaci exprese některých genů zahrnutých v procesu karcinogeneze (c-MYC, c-KIT, VEGF, a další).
Cílem této diplomové práce je studium schopnosti nového typu sloučenin potlačit expresi onkogen c-MYC rostřednictvím stabilizace G-kvadruplexových struktur přítomných v jeho promotorové oblasti. U některých z těchto sloučenin byly prokázány významné nádorově specifické cytotoxické účinky. Kromě toho, výsledky DNA polymerázové stop eseje prokázaly silnou interakci testovaných látek s G-kvadruplexovou DNA.
V tomto diplomovém projektu bude zavedena a optimalizována duální luciferázová reportérová esej pro prvotní stanovení vlivu studovaných derivátů na expresi daných onkogenů a výběr nejúspěšnějších struktur pro účely dalšího testování. Duální reportérová luciferázová esej je velice dobrým nástrojem pro screening účinnosti interakce malých molekul s G-kvadruplexy a umožňuje otestovat velký soubor sloučenin najednou. Metoda je založena na měření aktivity enzymu luciferázy. Pro tyto účely bude zkonstruován pGL4.10[luc2;c-myc] vektor nesoucí syntetický gen luciferázy z Photinus pyralis, jehož exprese bude řízena vloženým minimálním promotorem c-MYC. Následně bude konstrukt přechodně transfekován do lidské nádorové linie exprimující daný onkogen.
Schopnost heterocyklických kationtů selektivně stabilizovat kvadruplexovou DNA bude studována pomocí metody fluorescenčního resonančního přenosu energie (FRET). Tato metoda poslouží pro zúžení výběru vhodných kandidátů pro další zkoumání.
Dále bude u sloučenin, vybraných předchozím screeningem, určena cytotoxicita (XTT test) na příslušné lidské nádorové buněčné lini (HeLa) a na lidských endoteliálních buňkách (HUVEC). Schopnost inhibice exprese c-myc bude u nejúspěšnějších sloučenin ověřena na úrovni mRNA a proteinu.
Výsledky získané v tomto projektu poskytnou cennou zpětnou vazbu pro chemickou syntézu s cílem optimalizovat požadovanou aktivitu a selektivitu studovaných sloučenin.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

As G-quadruplex structures are enriched near transcription and translation start sites, they can modulace these proceses. Such sequences have subsequently found to be widely prevalent in the human genome, with a particular over-representation in genes involved in proliferation, notably in oncogenes such as c-MYC, c-KIT, VEGF and others.
The aim of this thesis is to study the ability of the new type of compounds to suppress expression of c-myc gene due to stabilization of G-quadruplex structures present in its promoter. Some of these compounds have been proved to be specifically cytotoxic against cancer cells. Besides, the results of DNA polymerase stop assay revealed the strong interaction between tested compounds and G-qudruplexes.
The first scope of this thesis will be to introduce and optimize dual luciferase reporter assay (DLR) for the primary screen of studied compounds for their effect on expression of c-myc and selection of the best of them for further investigation. DLR is useful tool for monitoring and of interactionf of small ligands with G-quadruplexes, which allows high throughput screening. This method is based on measurement of luciferase gene expression reporter activity. For this purpose, pGL4.10[luc2; c-myc] will be constructed. This vector carries gene encoding luciferase from Photinus pyralis driven by inserted minimal promoter of c-myc. Subsequently, the transient transfection of human cancer cell line expressing c-myc will be carried out. The selectivity of tested compounds for quadruplex DNA will be studied using fluorescence resonance energy transfer (FRET). This method will help us to reduce the number of candidates for further examination.
Further, the compounds selected by previous screening will be test for their cytotoxicity against both cancer cell line (HeLa) and normal cell line (human endothelial cells; HUVEC) by XTT. Finally, the effect of the most successful compounds on the expression of c-myc will be assessed.
The results of this thesis will provide feedback to chemical synthesis with the goal to optimize the activity and selectivity of these compounds.