Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae

• Název práce v češtině: Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae
• Název v anglickém jazyce: Analysis of signaling cascade of protein kinase StkP in Streptococcus pneumoniae
• Klíčová slova: LocZ, MapZ, Spr0334, serin/threoninová proteinkinasa, StkP, serin/threoninová proteinfosfatasa, PhpP, buněčné dělení, Streptococcus pneumoniae, fosforylace
• Klíčová slova anglicky: LocZ, MapZ, Spr0334, serine/threonine protein kinase, StkP, serine/threonine protein phosphatase, PhpP, cell division, Streptococcus pneumoniae, phosphorylation
• Akademický rok vypsání: 2012/2013
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
• Vedoucí / školitel: RNDr. Linda Doubravová, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 15.10.2012
• Datum zadání: 15.10.2012
• Datum odevzdání elektronické podoby: 19.05.2020
• Datum proběhlé obhajoby: 12.06.2020
• Oponenti: RNDr. Irena Lichá, CSc.

Předběžná náplň práce

Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumonaie je nejen významný lidský patogen, ale také vhodný modelový organismus ke zkoumání buněčného dělení u ovoidních bakterií. Tato bakterie postrádá oba systémy výběru místa buněčného dělení Min a NO, a tedy mechanismus, jakým určuje místo, ve kterém nastane buněčné dělení, je neznámý. Navíc ve svém genomu kóduje jedinou serin/threoninovou proteinkinasu eukaryotického typu nazývanou StkP a jedinou serin/threoninovou proteinfosfatasu PP2C typu nazývanou PhpP. StkP je jedním z hlavních regulátorů buněčného dělení a pravděpodobně ovlivňuje průběh buněčného dělení i fosforylací svých substrátů, mezi které mimo jiné patří proteiny buněčného dělení FtsZ, FtsA, DivIVA, MacP, Jag/KhpB/EloR a LocZ/MapZ.
První projekt této disertační práce se zabývá určením funkce proteinu LocZ v rámci buněčného dělení. Souhrnně, locZ sice není esenciální, ale účastní se procesu výběru místa dělení u S. pneumoniae a naše výsledky napovídají, že patří mezi pozitivní regulátory umístění Z-kruhu. Buňky s deplecí LocZ jsou schopny tvořit Z-kruh, ale ten je prostorově špatně umístěn, což má za následek defekty v buněčném dělení, deformity buněčného tvaru a tvorbu nerovnoměrně rozdělených dceřiných buněk, které občas neobsahují žádnou DNA. LocZ má unikátní lokalizační vzor. Do buněčného středu přichází časně, ještě dříve než FtsZ a FtsA. Stejně tak i z buněčného středu odchází, časně a dříve než FtsZ a FtsA, přičemž putuje s ekvatoriálními kruhy, které značí budoucí místo buněčného dělení. Domníváme se, že za tuto lokalizaci je zodpovědná extracelulární doména proteinu. Zajímavé je, že homology proteinu LocZ se vyskytují pouze u streptokoků, enterokoků a laktokoků, což naznačuje, že tato skupina fylogeneticky blízkých bakterií si vyvinula unikátní mechanismus, jak určit buněčný střed.
Druhý projekt této disertační práce se zabývá esencialitou a funkcí proteinfosfatasy PhpP v neopouzdřeném kmeni S. pneumoniae Rx1, ve kterém byl gen phpP dříve postulován jako esenciální. Přípravou životaschopného kmene ΔphpP a následným testem transformační kinetiky jsme vyvrátili esencialitu phpP. Demonstrujeme, že PhpP negativně řídí úroveň fosforylace u S. pneumoniae a to přímou defosforylací svých substrátů a současně defosforylací kinasy StkP. Nepřítomnost anebo katalytická inaktivace PhpP má za následek hyperfosforylaci substrátů StkP a fenotypové změny včetně citlivosti k určitým environmentálním stresům. Morfologicky se deplece PhpP projevuje tvorbou menších kulatých buněk, což reflektuje fenotyp pozorovaný u buněk kmene nadprodukujícího StkP. A naopak nadprodukce PhpP má za následek elongaci buněk, což mimikuje fenotyp ΔstkP kmene. Naše výsledky dokazují, že PhpP a StkP společně regulují buněčné dělení u S. pneumoniae.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Analysis of signaling cascade of protein kinase StkP in Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae is not only an important human pathogen but also an appropriate model organism to investigate cell division in ovoid bacteria. This bacterium lacks both, NO and Min systems for selection of cell division site. Thus, the mechanism which determines the site of cell division is unknown. Additionally, the genome of S. pneumoniae encodes a single gene for eukaryotic-like serine/threonine protein kinase StkP and a single gene for eukaryotic-like serine/threonine protein phosphatase of PP2C type called PhpP. StkP is one of the main regulators of cell division. Cell division is probably affected by the phosphorylation of its substrates, which include, among others, cell division proteins FtsZ, FtsA, DivIVA, MacP, Jag/KhpB/EloR, and LocZ/MapZ.
The aim of the first project of this dissertation thesis is determination of the function of protein LocZ in the cell division. In summary, locZ is not essential, however, it is involved in proper septum placement in S. pneumoniae and our data suggest that it is a positive regulator of Z-ring placement. Cells lacking LocZ are able to form Z-ring, but the Z-ring is spatially misplaced resulting in cell division defects, shape deformation, and generation of unequally sized, occasionally anucleated daughter cells. LocZ has a unique localization pattern. It arrives early at midcell, before FtsZ and FtsA. Likewise, it also leaves the septum early, apparently moving along with the equatorial rings that mark the future division sites. We propose that the extracellular domain of the protein LocZ is responsible for this localization. Interestingly, homologs of LocZ are found only in streptococci, enterococci and lactococci, indicating that these phylogenetically closely related bacteria evolved a unique mechanism to find their middle.
The second project of this thesis is concerned with the essentiality of protein phosphatase PhpP in the S. pneumoniae Rx1 unencapsulated strain, in which the gene phpP was previously postulated as essential. We prepared a viable ΔphpP strain and excluded selection of suppressor mutation by transformation kinetic analysis, thus confirming that phpP gene is not essential. We demonstrate that PhpP negatively controls the level of protein phosphorylation in S. pneumonaie both by direct dephosphorylation of its substrates and by dephosphorylation of its cognate kinase, StkP. Absence or catalytic inactivation resulted in the hyperphosphorylation of StkP substrates and specific phenotypic changes, including sensitivity to certain environmental stresses. Morphologically is depletion PhpP manifested by the formation of smaller spherical cells that reflect phenotype of StkP overexpression. Conversely, the overproduction of PhpP resulted in cell elongation mimicking the stkP null phenotype. Our results suggest that PhpP and StkP cooperatively regulate cell division of S. pneumoniae.