Molekulární metody v taxonomii a epidemiologii dermatofyt

• Název práce v češtině: Molekulární metody v taxonomii a epidemiologii dermatofyt
• Název v anglickém jazyce: Molecular methods used for taxonomy and epidemiology of dermatophytes
• Klíčová slova: dermatofytické houby, Trichophyton, Microsporum, druhový koncept, polyfázická taxonomie, molekulární typizace, fylogenetická analýza, analýza mikrosatelitů, sekvenování, PCR-fingerprinting
• Klíčová slova anglicky: dermatophytic fungi, Trichophyton, Microsporum, species concept, polyphasic taxonomy, molecular typing, phylogenetic analysis, microsatellite analysis, molecular sequencing, PCR-fingerprinting
• Akademický rok vypsání: 2011/2012
• Typ práce: bakalářská práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra botaniky (31-120)
• Vedoucí / školitel: MUDr. Mgr. Vít Hubka, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 26.07.2012
• Datum zadání: 26.07.2012
• Datum odevzdání elektronické podoby: 15.05.2013
• Datum proběhlé obhajoby: 11.06.2013
• Oponenti: doc. MUDr. Petr Hamal, Ph.D.
• Konzultanti: Mgr. Miroslav Kolařík, Ph.D.

Předběžná náplň práce

TEORETICKÝ ÚVOD
Dermatofytózy patří k nejběžnějším onemocněním člověka, jejichž prevalence se pohybuje v desítkách procent i ve vyspělých zemích. Většina těchto infekcí je v našich podmínkách působena antropofilním druhem Trichophytom rubrum, který ještě v první polovině 20. století byl druhem velmi vzácně izolovaným. Obdobně se dají pozorovat posuny i ve druhovém složení dermatofyt zoofilních. Jak naznačily molekulární analýzy, klasická taxonomie dermatofyt založená z velké části na morfologických znacích pravděpodobně značně nadhodnotila počet druhů dermatofyt. Koncept řady druhů se s nástupem molekulárních metod značně změnil a některé druhy podpořené znaky molekulárními často nenachází podporu v morfologických znacích. Další otázky do diskuze o druhovém konceptu dermatofyt přinesly experimenty indukující teleomorfu křížením opačně laděných izolátů. Z výsledků těchto pokusů není zcela jasné, zda je u dermatofyt biologický koncept druhu zcela aplikovatelný a do jaké míry jsou získaní kříženci skutečně jedinci jednoho druhu a do jaké míry se může jednat o mezidruhové hybridy. Taxonomie dermatofyt prochází významnými změnami a současně je předními výzkumnými skupinami raženo několik velmi rozdílných konceptů.
Typizaci kmenů na nižší než druhové úrovni je nezastupitelná pro epidemiologické šetření zjišťující zdroje nákazy přenesené z prostředí, ze zvířat, či z mezilidského kontaktu. Zvláštní význam pro medicínu a pracovní lékařství má pak zjišťování původu profesionálních nákaz u pracujících se zvířaty. Na rozdíl od T. rubrum a Microsporum canis nejsou informace o struktuře populace většinou dostupné pro další druhy a i možnosti typizace jsou tedy omezené. Pro některé významné druhy je ale znám kompletní genom, který by usnadnil případné hledání lokusů vhodných pro typizaci.

CÍLE
(1) Shrnutí molekulárních metod použitých v taxonomii dermatofyt - druhová úroveň
- sekvenace (cílové geny a jejich rozlišovací schopnost; ITS, SSU, actin, β-tubulin, MnSOD, aj.), GCPSR, PCR-RFLP, PCR-fingerprintové metody aj.
(2) Porovnání druhových konceptů u dermatofyt
- morfologicko-fyziologický, molekulárně-genetický, GCPSR, biologický a polyfázický koncept (Gräser, Ellis, Kawasaki, aj.); struktura MAT lokusu u dermatofyt a křížící pokusy
(3) Přehled metod typizace dermatofyt na nižší než druhové úrovni
- analýza mikrosatelitů, PCR-fingerprintové metody, MLST (multi-locus sequnce typing), aj.
- konrétní příklady využití v epidemiologii
- u kterých dalších druhů by bylo vhodné vytvořit typizační schémata z hlediska významnosti pro člověka? (antropofilní; zoofilní s častým přenosem na člověka; geofilní?)

VYBRANÉ LITERÁRNÍ ZDROJE
Abdel-Rahman, S. M., T. Sugita, G. M. González, et al. (2010) Divergence among an international population of Trichophyton tonsurans isolates. Mycopathologia 169: 1-13.
Cafarchia, C., D. Otranto, S. Weigl, et al. (2009) Molecular characterization of selected dermatophytes and their identification by electrophoretic mutation scanning. Electrophoresis 30: 3555-3564.
Gräser, Y., G. S. De Hoog et A. F. A. Kuijpers (2000) Recent advances in the molecular taxonomy of dermatophytes. Revista Iberoamericana de Micologia 17: 17-21.
Gräser, Y., M. El Fari, W. Presber, W. Sterry et H. J. Tietz (1998) Identification of common dermatophytes (Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton) using polymerase chain reactions. Brit J Dermatol 138: 576-582.
Gräser, Y., J. Fröhlich, W. Presber et S. de Hoog (2007) Microsatellite markers reveal geographic population differentiation in Trichophyton rubrum. Journal of Medical Microbiology 56: 1058-1065.
Graser, Y., A. F. A. Kuijpers, W. Presber et G. S. De Hoog (2000) Molecular taxonomy of the Trichophyton rubrum complex. J Clin Microbiol 38: 3329-3336.
Gräser, Y., J. Scott et R. Summerbell (2008) The new species concept in dermatophytes - a polyphasic approach. Mycopathologia 166: 239-256.
Hryncewicz-Gwóźdź, T. Jagielski, A. Dobrowolska, J. C. Szepietowski et E. Baran (2011) Identification and differentiation of Trichophyton rubrum clinical isolates using PCR-RFLP and RAPD methods. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 30: 727-731.
Kanbe, T., Y. Suzuki, A. Kamiya, et al. (2003) Species-identification of dermatophytes Trichophyton, Microsporum and Epidermophyton by PCR and PCR-RFLP targeting of the DNA topoisomerase II genes. J Dermatol Sci 33: 41-54.
Kano, R., M. Kawasaki, T. Mochizuki, M. Hiruma et A. Hasegawa (2012) Mating genes of the Trichophyton mentagrophytes complex. Mycopathologia 173: 103-112.
Kano, R., T. Yamada, K. Makimura, et al. (2011) Arthroderma benhamiae (The Teleomorph of Trichophyton mentagrophytes) Mating Type-Specific Genes. Mycopathologia 171: 333-337.
Kawasaki, M. (2011) Verification of a taxonomy of dermatophytes based on mating results and phylogenetic analyses. Med Mycol J 52: 291-295.
Kawasaki, M., K. Anzawa, T. Mochizuki, H. Ishizaki et B. M. Hemashettar (2009) Successful Mating of a Human Isolate of Arthroderma simii with a Tester Strain of A. vanbreuseghemii. Japanese Journal of Medical Mycology 50: 15-18.
Kawasaki, M., K. Anzawa, K. Takeda, et al. (2008) Genetic and phenotypic variations among F1 progenies of Arthroderma benhamiae. Japanese Journal of Medical Mycology 49: 103-110.
Kawasaki, M., K. Anzawa, A. Wakasa, et al. (2008) Different genes can result in different phylogenetic relationships in Trichophyton species. Japanese Journal of Medical Mycology 49: 311-318.
Khosravi, A., F. Behzad, A. Sabokbar, et al. (2010) Molecular typing of Epidermophyton floccosum isolated from patients with dermatophytosis by RAPD-PCR. Journal of Basic Microbiology 50: S68-S73.
Mochizuki, T., M. Kawasaki, K. Anzawa, et al. (2008) Epidemiology of sporadic (non-epidemic) cases of Trichophyton tonsurans infection in Japan based on PCR-RFLP analysis of non-transcribed spacer region of ribosomal RNA gene. Jpn J Infect Dis 61: 219-222.
Mochizuki, T., M. Kawasaki, H. Ishizaki, et al. (2001) Molecular epidemiology of Arthroderma benhamiae, an emerging pathogen of dermatophytoses in Japan, by polymorphisms of the non-transcribed spacer region of the ribosomal DNA. J Dermatol Sci 27: 14-20.
Mochizuki, T., H. Tanabe, M. Kawasaki, H. Ishizaki et C. J. Jackson (2003) Rapid identification of Trichophyton tonsurans by PCR-RFLP analysis of ribosomal DNA regions. J Dermatol Sci 32: 25-32.
Ohst, T., S. De Hoog, W. Presber, V. Stavrakieva et Y. Gräser (2004) Origins of microsatellite diversity in the Trichophyton rubrum-T. violaceum clade (dermatophytes). J Clin Microbiol 42: 4444-4448.
Rezaei-Matehkolaei, A., K. Makimura, G. S. De Hoog, et al. (2012) Discrimination of Trichophyton tonsurans and Trichophyton equinum by PCR-RFLP and by β-tubulin and Translation Elongation Factor 1-α sequencing. Med Mycol: DOI: 10.3109/13693786.2012.661885.
Sharma, R., S. De Hoog, W. Presber et Y. Gräser (2007) A virulent genotype of Microsporum canis is responsible for the majority of human infections. Journal of Medical Microbiology 56: 1377-1385.
Sharma, R., W. Presber, R. C. Rajak et Y. Gräser (2008) Molecular detection of Microsporum persicolor in soil suggesting widespread dispersal in central India. Med Mycol 46: 67-73.
Uchida, T., K. Makimura, K. Ishihara, et al. (2009) Comparative study of direct polymerase chain reaction, microscopic examination and culture-based morphological methods for detection and identification of dermatophytes in nail and skin samples. J Dermatol 36: 202-208.
Wakasa, A., K. Anzawa, M. Kawasaki et T. Mochizuki (2010) Molecular typing of Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale isolated in a university hospital in Japan based on the non-transcribed spacer region of the ribosomal RNA gene. J Dermatol 37: 431-440.
Wu, Y., J. Yang, F. Yang, et al. (2009) Recent dermatophyte divergence revealed by comparative and phylogenetic analysis of mitochondrial genomes. BMC genomics 10: 238.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

The work reviews molecular methods used in taxonomy and epidemiology of dermatophytes.
The aims:
1) To summarise molecular genetic methods used in the taxonomy of dermatophytes - at the species level
- molecular sequencing (genes used for construction of phylogeny of dermatophytes and the ability of particular genes to discriminate between species - ITS, SSU, actin, β-tubulin, MnSOD, aj.), GCPSR, PCR-RFLP, PCR-fingerprinting methods
(2) To compare different species concepts in the taxonomy of dermatophytes
- phenotypic, genetic, GCPSR, biological and polyphasic species concept (Gräser, Ellis, Kawasaki, etc.); MAT locus organisation and mating experiments
(3) Overview of the molecular typing methods used at the subspecies level
- microsatellite analysis, PCR-fingerprinting, MLST (multi-locus sequnce typing), etc.
- to present examples of molecular epidemiology methods application
- to discuss and propose particular species suitable for development of typing schemes (antropophilic; zoophilic with possible transmission to human; geophilic species)