Studium transmembránového transportu iontů: měření změn vnitrobuněčné koncentrace iontů v bakteriích

• Název práce v češtině: Studium transmembránového transportu iontů: měření změn vnitrobuněčné koncentrace iontů v bakteriích
• Název v anglickém jazyce: Study of Transmembrane Transport of Ions: Measurement of Intracellular Concentration Changes of Cations in Bacteria
• Akademický rok vypsání: 2011/2012
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Fyzikální ústav UK (32-FUUK)
• Vedoucí / školitel: RNDr. Roman Chaloupka, Ph.D.

Zásady pro vypracování

1. Seznámit se s problematikou používání fluorescenčních sond v biovědách, osvojit si základní techniky práce v mikrobiologické laboratoři, kultivaci bakteriálních buněk a základní principy fluorescenční spektroskopie.
2. Vypracovat stručný přehled fluorescenčních sond použitelných pro měření intracellulární koncentrace iontů a zhodnotit jejich použitelnost pro měření v bakteriálních buňkách.
3. Vypracovat literární přehled využití fluorescenčních proteinů při detekci vápníku, případně dalších iontů.
4. Zhodnotit předpokládanou využitelnost fluorescenčních sond a dosud známých fluorescenčních proteinů citlivých na vápník pro měření intracelulární koncentrace jiných dvojmocných iontů, jako např. manganu, kadmia či kobaltu.
5. Na základě předchozího bodu vybrat několik fluorescenčních proteinů vhodných pro měření změn intracelulární koncentrace dvojmocných iontů vyvolaných transmembránovým transportem a otestovat v bakteriích E. coli s hyperexprimovaným transportérem MntH.
6. Optimalizovat podmínky měření v živých bakteriích pro nejvhodnější z testovaných fluorescenčních proteinů.
4. Event. charakterizovat funkci tranportního proteinu MntH pomocí měření změn pH a vnitrobuněčné koncentrace dvojmocných kovových iontů vyvolaných funkcí MntH.

Seznam odborné literatury

1. R.P. Haughland: The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies, Invitrogen Corp. 2005.
2. Miyawaki,A.; Griesbeck,O.; Heim,R.; Tsien,R.Y.: Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999):2135-2140.
3. Courville,P.; Chaloupka,R.; Cellier,M.F.M. Biochemistry and Cell Biology 84 (2006): 960-978.
4. Chaloupka,R., Courville,P., Veyrier,F., Knudsen,B., Tompkins,T.A., Cellier,M.F.M.: Biochemistry 44 (2005): 726-733.
5. L.Beranová: Studium funkce bakteriálních transportérů dvojmocných kovů, diplomová práce MFF UK 2007.
6. I.Doležalová: Stechiometrie transportu membránovým transportním proteinem MntH bakterie E. coli, diplomová práce MFF UK 2010.
7. vybraný soubor původních prací

Předběžná náplň práce

Proteiny z rodiny Slc11 (SoLute Carrier 11) transportují dvojmocné kovové ionty za pomoci symportu s protony u celé řady organismů - od bakterií (MntH - Manganese Proton-dependent Transporter) po člověka (Nramp - Natural Resistence Associated Membrane Protein) a hrají důležitou roli v homeostázi kovových iontů. I přes klíčovou fyziologickou roli těchto transportních proteinů jsou poznatky o mechanismu, jímž transportují dvojmocné kovové ionty, velmi sporé, zejména kvůli absenci vhodných experimentálních metod. Práce se pokusí najít další fluorescenční metody vhodné ke studiu transportu dvojmocných kovových iontů a protonů proteinem MntH bakterie E.coli. Práce se zaměří na fluorescenční sondy umožňující neinvazivní měření vnitrobuněčné koncentrace vápníku, které reagují také na přítomnost jiných dvojmocných iontů. Cílem práce bude nejen vypracovat rešerši metod používajících k detekci vápníku fúzní proteiny a zhodnotit jejich předpokládanou využitelnost pro měření vnitrobuněčné koncentrace jiných dvojmocných iontů, jako např. manganu, kadmia či kobaltu, ale rovněž testování použitelnosti vybraných fluorescenčních proteinů v bakteriích E. coli s hyperexrimovanými transportními proteiny MntH. Hlavním cílem práce je tedy vývoj a optimalizace fluorescenčních metod vhodných pro měření změn intracelulární koncentrace dvojmocných iontů v bakteriálních buňkách. Jelikož protein MntH je symportérem dvojmocných kovových iontů a protonů, paralelně bude věnována náležitá pozornost měření změn vnitrobuněčného pH vyvolaných transportem přes tento protein.