Regulation of transcription by proteins of the Early growth response and Myb families

• Název práce v češtině: Regulace transkripce proteiny rodin Early growth response a Myb
• Název v anglickém jazyce: Regulation of transcription by proteins of the Early growth response and Myb families
• Klíčová slova: transkripční faktor, EGR1, EGR4, c-Myb, v-Myb, sarkom, metastáze, myofibroblast, leukémie, diferenciace, melanocytogenese
• Klíčová slova anglicky: transcription factor, EGR1, EGR4, c-Myb, v-Myb, sarcoma, metastasis, myofibroblast, leukemia, differentiation, melanocytogenesis
• Akademický rok vypsání: 2007/2008
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Katedra biochemie (31-250)
• Vedoucí / školitel: RNDr. Michal Dvořák, CSc.
• Řešitel: skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 12.09.2011
• Datum zadání: 12.09.2011
• Datum potvrzení stud. oddělením: 12.09.2011
• Datum a čas obhajoby: 21.05.2013 09:00
• Datum odevzdání elektronické podoby: 18.02.2013
• Datum proběhlé obhajoby: 21.05.2013
• Oponenti: Ing. Tomáš Vomastek, Ph.D.

Předběžná náplň práce

Regulace transckripce desítek tisíc genů v organizmu obratlovců je mimořádně komplexním fenoménem, jehož se účastní tisíce různých regulačních proteinů. Největší funkční kategorií těchto regulátorů jsou sekvenčně specifické DNA vazebné proteiny známé jako transkripční faktory. Proteiny z EGR a Myb rodin transkripčních faktorů jsou relativně dlouho zkoumanými regulátory různých fyziologických procesů, včetně buněčné proliferace a diferenciace. Zatímco strukturální a fyzikální aspekty jejich funkce byly dobře charakterizovány, jejich buněčně specifická role v komplexních genově regulačních sítích není dostatečně prostudována a představuje hlavní výzvu v příslušných oblastech výzkumu. Předběžná analýza dat genové exprese z metastázujících buněk PR9692 a nemetastázujících buněk PR9692-E9 (kuřecích sarkomové linie) odhalila, že transkripční faktor EGR1 je syntetizován v relativně větším množství v metastázujících buňkách a může se tak podílet na regulačních procesech, které jsou základem rozdílů mezi oběma buněčnými liniemi. Dalším zkoumáním jsme zjistili, že cílené zvýšení hladiny EGR1 v PR9692-E9 buňkách obnovuje jejich metastatický potenciál na úroveň PR9692 buněk. Mikročipová analýza takových buněk odhalila aktivaci genů, které jsou rozhodující pro kontraktilitu aktinového cytoskeletu (MYL9), integrinovou signalizaci (RIAM), tvorbu filopodií (MYO10), produkci specifických složek mezibuněčné hmoty (HAS2, COL6A1-3) a další základní prometastatické schopnosti. Zvýšená exprese EGR1 v PR9692-E9 buňkách také vedla ke snížení exprese mnoha genů, z nichž některé byly identifikovány v jiných studiích jako metastatické supresory (SFRP4, IRX1 a CADM1).
Fibrotická onemocnění se vyznačují častým výskytem a vysokou úmrtností. Pochopení molekulárních mechanismů řídících vznik, progresi a možné potlačení fibrózy je předpokladem k vývoji úspěšné terapie. Ústřední roli v patogenezi fibrózy hrají buňky zvané myofibroblasty. Myofibroblast je specifický typ mesenchymální buňky charakterizovaný syntézou mezibuněčné hmoty, schopností kontrakce a sekreční aktivitou. Zatímco tyto buňky plní důležitou funkci během fyziologického hojení rány, mohou také způsobit devastující fibrózu za patologických podmínek. Zjistili jsme, že kuřecí embryonální kožní myofibroblasty (chicken embryo dermal myofibroblast - CEDM) představují užitečný ex vivo model vhodný pro analýzu myofibroblastického fenotypu a jeho regulace. Také jsme odhalili, že zvýšení proteinové hladiny EGR4 v těchto buňkách indukuje ztrátu typických myofibroblastických charakteristik. Dále jsme analyzovali tento efekt s ohledem na změny v aktivitě signálních drah a genové expresi po zvýšení hladiny EGR4. Jelikož je za hlavní signalizační systém řídící diferenciaci myofibroblastů považována TGF-β signální dráha, nejprve jsme identifikovali TGF-β regulované geny v CEDM buňkách pomocí specifického chemického inhibitoru kinasové aktivity TGF-β receptoru 1 a oligonukleotidových mikročipů. Nalezli jsme jak geny objevené dříve v savčích systémech (např. SPON2, ASPN, COMP, LUM, HAS2, IL6, CXCL12, VEGFA, NGF), tak i řadu nových TGF-β závislých genů, mezi nimi PGF, VEGFC, PTN, FAM180A, FIBIN, ZIC1, ADCY2, RET, HHIP, DNER a TMEM45A. Naše výsledky s dlouhodobou inhibicí TGF-β signalizace v buňkách CEDM naznačují, že TGF-β se primárně podílí na regulaci sekrece, včetně produkce mezibuněčné hmoty, zatímco kontraktilní aktivita závisí na dalších regulačních signálech. Dále jsme se zaměřili na mechanismy, které jsou použity proteinem EGR4 při vynucení dediferenciace v CEDM buňkách. Zjistili jsme, že trvale zvýšená hladina EGR4 způsobuje silnou inhibici TGF-β signalizace a také vede k potlačení exprese genů kódujících klíčové složky kontraktilního aparátu myofibroblastů. Mikročipová analýza odhalila řadu genů ovlivněných proteinem EGR4 a mezi nimi několik kandidátů, kteří mohou zprostředkovávat některé z pozorovaných účinků. Další experimenty vedly k hypotéze, že geny FOXG1, BAMBI, NAB1, NAB2 a DUSP5 společně tvoří EGR4 regulovanou síť potlačující autokrinní TGF-β signalizaci.
Výzkum úlohy proteinů Myb v procesech volby diferenciační linie v krvetvorbě a melanocytogenesi byl prováděn souběžně s výzkumem proteinů EGR. Vývoj krvinek z pluripotentních kmenových buněk probíhá postupně přes multipotentní progenitory až po zralé buňky náležející do nejméně 8 různých linií. Proces volby diferenciační linie, během kterého kmenové buňky a nezralé progenitory zvolí další směr diferenciace, je regulován prostřednictvím koordinované činnosti extracelulárních signálů a transkripčních faktorů. Molekulární mechanismy řídící tuto volbu jsou z větší části neznámé. V našich pokusech jsme identifikovali schopnost transkripčního faktoru v-Myb^AMV regulovat diferenciační rozhodnutí společného myeloidního progenitoru a více diferencovaných progenitorů myeloidní řady a odhalili jsme roli motivu leucinového zipu (LZ) v těchto efektech. Prokázali jsme, že v-Myb^AMV s neporušeným LZ řídí vývoj progenitorů do makrofágové linie. Mutace v tomto regionu zrušila výhradní makrofágovou diferenciaci nezralých krevních progenitorů a způsobila, že mutovaný v-Myb^AMV podporoval také diferenciaci buněk erytroidních, trombocytů a granulocytů, podobně jako protein c-Myb. Navrhli jsme proto hypotézu, že LZ může fungovat jako molekulární přepínač, který ovlivňuje expresi jiných klíčových transkripčních faktorů a řídí diferenciaci krvetvorných kmenových buněk buď do myeloidní nebo erythroidní linie.
Kromě krvetvorby jsme také prokázali schopnost proteinů c-Myb a v-Myb^AMV ovlivňovat volbu diferenciační linie v buňkách neurální lišty (NL), kde oba proteiny vynucují melanocytogenesi. Zvýšená koncentrace proteinu c-Myb podporuje vývoj dendritických melanocytů a terminální diferenciaci. Onkoprotein v-Myb^AMV převádí v podstatě všechny buňky NL do melanocytární řady a způsobuje jejich transformaci. Oba proteiny Myb aktivují v buňkách NL expresi genu c-kit, který kóduje receptor růstového faktoru SCF, a následně c-Kit signalizaci - jednu ze základních signálních drah ve vývoji melanocytů. Jelikož byl v předchozí studii c-kit identifikován jako cíl proteinů Myb v hematopoetických buňkách, naše pozorování naznačují, že c-Myb - c-Kit dráha představuje společný regulační systém pro hematopoetické progenitory a progenitory buněčných typů vznikajících z neurální lišty. Naše práce ukazuje nový experimentální model pro studium melanocytogenese a melanocytární transformace.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

The regulation of transcription of tens of thousands of genes in a vertebrate organism is an enormously complex phenomenon which entails the participation of thousands of various regulatory proteins. The largest functional category of these regulators is accounted for by sequence-specific DNA-binding proteins known as transcription factors. Proteins of the EGR and Myb families of transcription factors are long-studied regulators of a variety of physiological processes including cellular proliferation and differentiation. The structural and physical aspects of their function have been well characterized. Their cell-type specific participation in complex gene-regulatory networks, on the other hand, is still incompletely understood and represents a major challenge in the respective research areas.
Preliminary analysis of gene expression data from metastasizing PR9692 and non-metastasizing PR9692-E9 chicken sarcoma cell lines revealed that the transcription factor EGR1 is expressed at a higher level in metastasizing cells and can thus take part in the regulatory processes that underlie the differences between the two cell lines. Further investigation demonstrated that the introduction of exogenous EGR1 into PR9692-E9 cells restored their metastatic potential to a level indistinguishable from PR9692 cells. Microarray analysis of EGR1 reconstituted cells revealed the activation of genes that are crucial for actin cytoskeleton contractility (MYL9), integrin signaling (RIAM), filopodia formation (MYO10), the production of specific extracellular matrix components (HAS2, COL6A1-3) and other essential pro-metastatic abilities. Constitutive expression of EGR1 in PR9692-E9 cells also decreased the expression of numerous genes some of which have been identified in other studies as metastasis suppressors (SFRP4, IRX1 and CADM1).
Fibrotic diseases are a group of pathologies with high incidence and mortality. Understanding the molecular mechanisms driving the onset, progression and possible resolution of fibrosis is a prerequisite to the development of successful therapies. The central role in fibrosis is played by myofibroblasts. The myofibroblast is a specific type of mesenchymal cell characterized by synthesis of the extracellular matrix (ECM), plus contractile and secretory activity. While these cells serve a beneficial function during physiological tissue wound healing, they can cause devastating fibrosis under pathological conditions. We have established that chicken embryo dermal myofibroblasts (CEDM) represent a useful ex vivo model suitable for analyses of the myofibroblastic phenotype and regulation. We have also revealed that increasing the protein level of EGR4 in these cells induces a loss of myofibroblastic characteristics. We further analyzed this effect with respect to alterations in activity of signaling pathways and gene expression changes after EGR4 overexpression. As the major signaling system driving the differentiation of myofibroblasts is the TGF-β signaling pathway, we first identified TGF-β-regulated genes in CEDM cells using a specific chemical inhibitor of kinase activity of TGF-β receptor 1 and oligonucleotide microarrays. We revealed both genes previously reported in mammalian systems (e.g. SPON2, ASPN, COMP, LUM, HAS2, IL6, CXCL12, VEGFA, NGF) and novel TGF-β-dependent genes, among them PGF, VEGFC, PTN, FAM180A, FIBIN, ZIC1, ADCY2, RET, HHIP, DNER and TMEM45A. Our results on the long term inhibition of TGF-β signaling in CEDM cells suggests that TGF-β is primarily involved in the regulation of secretory activities including ECM production while contractile activity depends on additional regulatory signals. Next, we focused on the mechanisms that are employed by EGR4 to induce the observed dedifferentiation in CEDM cells. We found that sustained expression of EGR4 caused a strong inhibition of TGF-β signaling and also a suppression of the expression of genes encoding key components of the myofibroblast contractile apparatus. Microarray analysis identified a number of genes affected by EGR4 and among them a few candidates that may mediate some of the observed effects. Further experiments led to a hypothesis that FOXG1, BAMBI, NAB1, NAB2 and DUSP5 genes together form an EGR4 regulated network counteracting autocrine TGF-beta signaling.
Research on the role of Myb proteins in lineage commitment in hematopoiesis and melanocytogenesis was being performed in parallel with the EGR-related research. The development of blood cells proceeds from pluripotent stem cells through multipotent progenitors into mature elements belonging to at least 8 different lineages. The lineage choice process during which stem cells and progenitors commit to a particular lineage is regulated by a coordinated action of extracellular signals and transcription factors. Molecular mechanisms controlling commitment are largely unknown. We identified the ability of the transcription factor v-Myb^AMV to regulate the commitment of a common myeloid progenitor and progenitors restricted to the myeloid lineage and the role of its leucine zipper region (LZR) in these effects. We demonstrated that wild-type v-Myb^AMV with the intact LZR directs development of progenitors into the macrophage lineage. Mutations in this region compromised commitment toward myeloid cells and caused v-Myb^AMV to also support the development of erythroid cells, thrombocytes, and granulocytes, similar to the c-Myb protein. We proposed that Myb LZR can function as a molecular switch, affecting expression of lineage-specifying transcription factors and directing the development of hematopoietic progenitors into either myeloid or erythroid lineages.
In addition to hematopoiesis, we also demonstrated cell fate-directing abilities of c-Myb and v-Myb^AMV proteins in avian neural crest (NC), where both proteins determine melanocytogenesis. The increased concentration of c-Myb induced progression into dendritic melanocytes and differentiation. The v-Myb^AMV oncogene converted essentially all NC cells into melanoblasts and caused their transformation. Both Myb proteins activated in NC cells the expression of the c-kit gene and SCF - c-Kit signaling – one of the essential pathways in melanocyte development. As c-kit was identified as a target of Myb proteins in hematopoietic cells in a previous study, our observations suggest that the c-Myb - c-Kit pathway represents a common regulatory scheme for both hematopoietic and NC-derived progenitors. Our work establishes a novel experimental model for studies of melanocytogenesis and melanocyte transformation.