Rekombinantní viry vakcinie pro nádorovou terapii, analyza biologickych a biochemickych vlastností.

• Název práce v češtině: Rekombinantní viry vakcinie pro nádorovou terapii, analyza; biologickych a biochemickych vlastností.
• Název v anglickém jazyce: Recombinant vaccinia virus for cancer therapy, the analysis; of biological and biochemical features.
• Klíčová slova: virus vakcinie, Flt3L, TGF beta, imunita, nádory
• Klíčová slova anglicky: vaccinia virus, Flt3L, TGF beta, immunity, tumor.
• Akademický rok vypsání: 2003/2004
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
• Vedoucí / školitel: RNDr. Šárka Němečková, DrSc.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 12.03.2010
• Datum zadání: 12.03.2010
• Datum odevzdání elektronické podoby: 02.03.2011
• Datum proběhlé obhajoby: 21.04.2011
• Oponenti: doc. RNDr. Jitka Forstová, CSc.

Předběžná náplň práce

Virus vakcínie lze využít pro vyvolání imunitní reakce proti virem produkovanému heterolognímu proteinu a organismus tak připravit na obranu proti přirozenému producentu tohoto antigenu, např. viru nebo nádorových buněk. V naší laboratoři jsou vyvíjeny vakcíny proti nádorům způsobeným lidským papilomavirem typu 16 (HPV16). Používají se rekombinantní viry vakcínie odvozené z replikujícího se kmene P13 nebo atenuovaného MVA. Rekombinantní viry byly použity v profylaktických i terapeutických schématech léčby u myšího modelu nádorových buněk TC-1 či TC-1/A9. Rekombinanty exprimovaly papilomavirový onkogen E7 ve formě vysoce imunogenního SigE7LAMP fúzního konstruktu. Pro podporu imunitního systému byly do virů vloženy navíc i geny pro stimulační cytokiny GM-CSF nebo Flt3 ligand, které vykazují adjuvantní vlastnosti při vyvolání protinádorových odpovědí. Pro imunomodulaci nádorového mikroprostředí byly do rekombinantních virů vloženy geny pro solubilní receptory pro TGF-beta, jejichž funkcí bylo snížit inhibiční vliv nádorového cytokinu TGF-beta. Intratumorální či intraperitoneální podání virů vedlo ke zvýšení protinádorové odpovědi, u virů exprimujících Flt3 ligand také ke zvýšení počtu cytotoxických E7-specifických T lymfocytů. Exprese GM-CSF a Flt3 ligandu zabránila vzniku supresorových MDSC buněk, ale exprese receptoru pro TGF-beta překvapivě neovlivnila počet supresorových T-regulačních lymfocytů. Dále jsme zjistili, že silná exprese Flt3 ligandu in vitro u jednoduché rekombinanty vedla ke změnám v proteinovém složení virionů. Málo glykosylovaná molekula ligandu je inkorporována do virionu, docházelo ke špatnému proteolytickému štěpení proteinů virového jádra a ke změnám v obsahu hlavních virových membránových proteinů. Virus byl inhibován při množení v buněčných kulturách krevního původu a v myších ováriích. Inhibice in vivo měla také ve srovnání s málo produkujícím virem za následek sníženou hladinu Flt3 ligandu v séru infikovaných myší.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Recombinant vaccinia virus has been used for elicitation of the immune response against expressed heterologous proteins which has led to protection of the host organisms against the agents producing that antigen (viruses, cancer cells). In our laboratory, we designed and evaluated several vaccines against cancer caused by human papillomavirus type 16 (HPV16). Vaccinia viruses derived from replication competent strain P13 or attenuated MVA were used for construction of recombinant viruses expressing HPV16-E7 in highly immunogenic fusion construct SigE7LAMP. Recombinant viruses were used both in prophylactic and therapeutic settings in mouse tumor models using TC-1 or TC-1/A9 cells. The genes encoding stimulatory cytokines GM-CSF or Flt3 ligand were inserted into the above viruses to support the immune system and to potentiate the anticancer response. Tumor microenvironment was modified using the recombinant viruses expressing both the E7 gene and soluble receptor for TGF-betawhich should decrease the inhibition of immune system caused by tumor TGF-beta cytokine and elicit the response against tumor cells. Intratumoral or intraperitoneal administration of viruses enhanced anticancer response in mice, the viruses expressing Flt3 ligand induced the proliferation of E7-specific cytotoxic T lymphocytes. The expression of GM-CSF and Flt3 ligand prevented the formation of suppressor cells MDSC; however, the expression of receptor for TGF-beta did not influence the numbers of suppressor regulatory T lymphocytes.We further determined that the strong Flt3 ligand expression by single recombinant virus led to several changes in protein composition of virions in vitro. The low-glycosylated molecule of the ligand was incorporated into virion core, proteolytical cleavage of viral proteins was incorrect and there were also changes in composition of major viral membrane proteins. The virus multiplication was affected in cell cultures derived from hematopoietic cells as well as in mouse ovaries. The attenuation of virus in vivo has led also to decreased Flt3 ligand level in serum of infected mice in comparison with other recombinant viruses expressing the cytokine.