Adaptace cytoplazmatické membrány neprodukčního kmene Bacillus subtilis k surfaktinu.
| Název práce v češtině: | Adaptace cytoplazmatické membrány neprodukčního kmene Bacillus subtilis k surfaktinu. |
|---|---|
| Název v anglickém jazyce: | Cytoplasmic membrane adaptation to surfactin in Bacillus subtilis non-producing strain |
| Klíčová slova: | Bacillus subtilis, surfaktin, cytoplazmatická membrána, rezistence |
| Klíčová slova anglicky: | Bacillus subtilis, surfactin, cytoplasmic membrane, resistance |
| Akademický rok vypsání: | 2007/2008 |
| Typ práce: | diplomová práce |
| Jazyk práce: | čeština |
| Ústav: | Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140) |
| Vedoucí / školitel: | doc. RNDr. Jaroslava Svobodová, CSc. |
| Řešitel: | skrytý - zadáno vedoucím/školitelem |
| Datum přihlášení: | 19.06.2008 |
| Datum zadání: | 30.09.2010 |
| Datum odevzdání elektronické podoby: | 20.09.2010 |
| Datum proběhlé obhajoby: | 20.09.2010 |
| Oponenti: | doc. RNDr. Radovan Fišer, Ph.D. |
| Předběžná náplň práce |
| Surfaktin je sekundárním metabolitem některých kmenů B.subtilis, produkovaným při vstupu do stacionární fáze růstu a v průběhu sporulace. Vykazuje vysokou povrchovou aktivitu a antibakteriální účinek. Mutace v genech jeho biosyntézy ruší schopnost bakterií pohybovat se aktivně na agarových plotnách a naznačují tak funkci surfaktinu ve fyziologii producenta.
Molekula surfaktinu, tvořená heptapeptidem esterifikovaným zbytkem mastné kyseliny má amfipatickou povahu a interaguje s membránovou dvojvrstvou. To vede k destabilizaci membrány a její permeabilizaci. Dosud nejsou k dispozici informace o adaptaci, ani mechanizmu rezistence membrány produkčních kmenů k této látce se slibným aplikačním potenciálem v oblasti ochrany přírody i v medicině. Právě neznalost těchto údajů omezuje dosahované výtěžky surfaktinu. Cílem diplomové práce proto bude zjistit, jak odpovídá neprodukční kmen B.subtilis na surfaktin v průběhu dlouhodobé jednorázové kultivace. Adaptace cytoplazmatické membrány neprodukčního kmene Bacillus subtilis 168 k?surfaktinu ?Surfaktin, jedna z?nejúčinnějších povrchově aktivních látek a antibiotikum, je sekundární metabolit bakterií rodu Bacillus. Díky amfipatické povaze interaguje surfaktin s membránovou dvojvrstvou, což vede k její destabilizaci a permeabilizaci. Nabízí se tedy otázka jak se producent surfaktinu toxickému působení této látky brání; mechanizmus rezistence producenta k surfaktinu není doposud znám. Hlavním cílem této diplomové práce byla proto charakterizace adaptivnívh procesů v cytoplazmatické membráně neprodukčního kmene B.?subtilis 168, ke kterým dochází v?přítomnosti surfaktinu. Kultivace B. subtlis probíhala na živném agaru s přídavkem surfaktinu, který byl získán z?produkčního kmene B. subtilis ATCC 21332. Bylo zjištěno, že?400 ?g surfaktinu/ml ?inhibuje růst bakterií B.?subtilis 168, zatímco 300 ?g surfaktinu/ml růst stimuluje. Nejprve procházejí obě bakteriální kultury tří hodinovou lag fázi, po které následuje exponenciální růst, a to pomalejší u inhibiční koncentrace a urychlený u stimulační koncentrace surfaktinu oproti kontrole. V přítomnosti obou koncentrací surfaktinu se v?cytoplazmatické membráně bakterií zvýšilo zastoupení fosfatidylserinu. Změny zaznamenané na povrchu memrány byly provázeny radikální obměnou? mastných kyselin fosfolipidů. Zcela se obrátil poměr nevětvených a větvených mastných kyselin a celkový obsah vysokotajících mastných kyselin 16:0 a 18:0 se zvýšil na 67%. Předpokládaná rigidizace vnitřní části membrány byla potvrzena měřením ustálené anizotropie fluorescence sondy DPH. Ve vzorcích membrán bakterií inhibovaných surfaktinem byla objevena přítomnost nového proteinu, který byl metodou hmotnostní spektrometrie MS-MALDI identifikován jako MntA (manganese-binding lipoprotein). Získaná data ukazují na rozsáhlé změny ve složení cytoplazmatické membrány v odpovědi na surfaktin a přispívají k porozumění její adaptace na tuto membránově aktivní látku. |
| Předběžná náplň práce v anglickém jazyce |
| Cytoplasmic membrane adaptation to surfactin in Bacillus subtilis? 168 non-producing strain
?Surfactin, the most potent surface active compound and antibiotic is produced by bacteria of the genus Bacillus. Surfactin interacts with membrane bilayers, that results in destabilization and permeabilization of this structure. However mechanism of surfactin self-resistance in the producer?s membrane is not understood. The aim of this study was to characterize the adaptive processes occurring at the level of cytoplasmic membrane of surfactin non-producing strain B.?subtilis 168, which was exposed to exogenously added surfactin during the exponential phase of growth. The cultivation protocol of B.?subtilis growth on agar media plates supplemented with surfactin was developed. Two surfactin concentrations that inhibit (400 ?g/ml) and even stimulate (300 ?g/ml)?the growth of B.?subtilis 168 strain were assessed. Surfactin brought about the growth arrest for 3 hours and the restored growth rate decreased in the case of inhibitory concentration, whereas the stimulatory concentration increased the growth rate and resulted in higher final density of the population. TLC was performed to analyze the polar head groups of membrane phospholipids. The portion of phosphatidylserine was found to increase at both surfactin concentrations. The change of the membrane surface was accompanied with the substantial reconstruction of membrane fatty acids as revealed by GC/MS. The content of 16:0 and 18:0 fatty acids considerably increased whereas the non-branched fatty acids decreased. The resulting rigidization of the membrane interior was confirmed by the steady-state fluorescence anisotropy of DPH. In the membrane proteom of bacteria inhibited by surfactin was detected a new protein, that was ?identified by MS-MALDI as manganese-binding lipoprotein MntA. The obtained data outline an extensive reconstruction of cytoplasmic membrane in response to surfactin and contribute to the understanding of the membrane tolerance strategy. |