Studium činnosti kvasinkových MDR pump pomocí fluorescenčních sond: účinek potenciálních inhibitorů

• Název práce v češtině: Studium činnosti kvasinkových MDR pump pomocí fluorescenčních; sond: účinek potenciálních inhibitorů
• Název v anglickém jazyce: Study of the performance of yeast MDR pumps by fluorescent; probes: effect of potential inhibitors
• Akademický rok vypsání: 2005/2006
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Fyzikální ústav UK (32-FUUK)
• Vedoucí / školitel: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.
• Řešitel: skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 07.10.2005
• Datum zadání: 07.10.2005
• Datum a čas obhajoby: 28.05.2007 00:00
• Datum odevzdání elektronické podoby: 28.05.2007
• Datum proběhlé obhajoby: 28.05.2007
• Oponenti: RNDr. Jan Krůšek, CSc.

Zásady pro vypracování

Prostudovat literaturu o membránovém potenciálu a mnohočetné lékové rezistenci, o technice měření pomocí fluorescenčních sond v živých buňkách a o účincích různých druhů stresu na kvasinkové buňky.

Zvládnout metodiku kultivace kvasinek.

Studium vlivu různých stresorů na fluorescenční vlastnosti potenciometrické sondy diS-C3(3) in vitro - optimalizace experimentálních podmínek.

Aplikace stresorů na živé systémy, studium odezvy buňky (membránového potenciálu a aktivity MDR pump) na stres.

Seznam odborné literatury

B. Halliwell, J. M. C. Gutteridge: Free Radicals in Biology and Medicine, Oxford Univ. Press, 1999
D. Gášková d Fluorescent probing of membrane potential in yeast: the role of cell wall in assays with diS-C3(3), YEAST , 14, (1998), 1189-1197.
Gášková,D. et al.: (2001). Factors underlying membrane-potential-dependent and –independent fluorescence responses of potentiometric dyes in stress-exposed cells: diS-C3(3) in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1511, 74-79.
Gášková, D. et al.: (2002). Monitoring the kinetics and performance of yeast membrane MDR transporters by diS-C3(3) fluorescence. Int. J. Biochemistry and Cell Biology. 34, 931-937.
Čadek R. et al.: (2004). Impact of the growth phase on the activity of multidrug resistance pumps and membrane potential of S. cerevisiae: effect of pump overproduction and carbon source. Biochim. Biophys. Acta, v tisku.
Decottignies A. et al.:. (2002). The pleiotropic drug MDR transporters from Saccharomyces cerevisiae, v: Microbial Multidrug Efflux, Horizon Scientific Press, Wymondham, UK, 155-175
A další časopisecká literatura dle pokynů vedoucího diplomové práce.

Předběžná náplň práce

V poslední době je mimořádná pozornost věnována membránovým proteinům patřícím do skupiny multidrug resistance transporterů (MDR). Tyto transportéry (pumpy) aktivně odstraňují cizorodé látky z buněk a tím umožňují rezistenci buněk vůči širokému spektru různých strukturně a funkčně odlišných látek (inhibitorů, léků, atd.). Negativně se tak uplatňují např. při odstraňování kvasinkových kontaminací, léčení infekcí apod. Tyto pumpy jsou přítomny v prokaryontech, kvasinkových buňkách i v živočišných buňkách včetně lidských.
Téma diplomové práce se týká vysoce aktuální problematiky - cíleného ovlivnění činnosti těchto membránových transportních proteinů, které jsou zodpovědné mj. za odolnost rakovinných buněk k cytostatikům a rezistenci mikrobiálních buněk k antibiotikům, biocidům, atd. Získané výsledky této práce by mohly mít značný praktický význam např. pro medicínu, desinfekci, ochranu životního prostředí, atd.
Pro studium obecných charakteristik buněčných procesů v eukaryontních buňkách je nejčastěji jako minimální model volena kvasinková buňka S. cerevisiae.
Hlavní náplní diplomové práce je studium vlivu chemických stresorů na aktivitu dvou hlavních MDR pump u kvasinek Saccharomyces cerevisiae - Pdr5p a Snq2p, s cílem nalézt látky, které by účinně činnost těchto pump inhibovaly. Měření budou prováděna pomocí fluorescenční metody, vyvinuté v oddělení biofyziky na FÚ UK, která umožňuje s vysokou citlivostí sledovat změny v aktivitě těchto pump v intaktních buňkách v relativně velmi dobře definovaného fyziologického stavu v reálném čase bezprostředně po přidání potenciálních inhibitorů. Metoda je založena na použití redistribuční potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3), která je současně substrátem pump Pdr5p a Snq2p. Pro interpretaci výsledků získaných fluorescenční metodou budou použity biologické techniky (výsevový a zónvý test) a fluorescenčně mikroskopického sledování vstupu propidium jodidu do buněk s porušenou plazmatickou membránou.
Práce má převážně experimentální charakter. Metodicky je zabezpečena na Fyzikálním ústavu UK, biologický materiál bude zajištěn ve spolupráci s Katedrou genetiky a mikrobiologie PřF UK a Laboratoří buněčné biologie MBÚ AVČR.