Náplní práce bude vývoj elektromigračních metod separace isomerů intaktních glykopeptidů s využitím kapilární elektroforézy s tandemovým hmotnostním analyzátorem typu Q-TOF. Nejčastěji používané separační podmínky jsou založeny na kyselých těkavých základných elektrolytech, které propůjčují glykopeptidům kladný celkový náboj a potlačují jejich nežádoucí adsorpci na stěny elektroforetické kapiláry. Pro separace isomerů s velmi podobnými strukturami však nemusí být tyto podmínky dostatečné. V některých případech je možno využít drobných rozdílů v hodnotách disociační konstanty kyseliny sialové vázané v glykopeptidech různými vazbami. V takových případech bude optimalizováno pH základního elektrolytu. Při vyšším pH může být nutné využít dynamické nebo permanentní pokrytí kapiláry, což bude rovněž předmětem optimalizace. Dalším nástrojem, který bude využit pro separace velmi obtízně separovatelných isomerů, bude afinitní kapilární elektroforéza s přídavkem lektinů do základního elektrolytu. Ty interagují různě silně s jednotlivými glykoformami peptidů a tím ovlivňují různou měrou jejich elektroforetickou mobilitu. Kvůli hmotnostní detekci bude pro tyto lektiny používána metoda částečného plnění kapiláry a budou proto muset být nejprve prozkoumány jejich elektromigrační vlastnosti. Další součástí projektu bude testování vlivu derivatizace peptidového řetězce glykopeptidů (propionylace, acetylace...). Bude studován vliv těchto jednoduchých modifikací na elektromigrační chování glykopeptidů a bude hodnocen jeho potenciál při řešení náročných separací isomerů. Konečným cílem je využití vyvinutých metod pro separace glykoforem glykopeptidů ve vzorcích pacientů v různých stádiích jaterních onemocnění a jejich aplikace pro včasnou diagnostiku těchto onemocnění.
Předběžná náplň práce v anglickém jazyce
The project will focus on the development of electromigration methods for the separation of intact glycopeptide isomers using capillary electrophoresis with a Q-TOF tandem mass spectrometry analyzer. The most frequently used separation conditions are based on volatile acidic background electrolytes that give glycopeptides positive net charge and suppress their undesired adsorption on the capillary wall. For separations of isomers with very similar structures, these conditions may not be sufficient. In some cases, it is possible to utilize small differences in dissociation constant values of sialic acid linked in different ways in glycopeptides. In such cases, the pH of the background electrolyte will be optimized. However, a higher pH may require usage of dynamic or permanent capillary coating, which will also be a subject of optimization. Another tool that will be utilized for separations of highly challenging isomers will be affinity capillary electrophoresis with the addition of lectins to background electrolyte. Lectins interact differently with individual peptide glycoforms affecting thus their electrophoretic mobility to different degree. Due to mass detection, the partial filling method will be used for these lectins and thus their electromigration behavior will have to be investigated first. Another part of the project will be testing the effect of derivatization of the peptide backbone of glycopeptides (propionylation, acetylation...). The effect of these simple modifications on the electromigration behavior of glycopeptides will be studied and its potential in solving challenging glycoform separations will be assessed. The ultimate goal is the application of the developed methods for separations of glycopeptide glycoforms in samples from patients in different stages of liver diseases and their application in early diagnosis.
