Experimental animal models and vectors of Leishmania (Mundinia)

• Název práce v češtině: Experimentální zvířecí modely a přenašeči leishmanií podrodu Mundinia
• Název v anglickém jazyce: Experimental animal models and vectors of Leishmania (Mundinia)
• Klíčová slova: Mundinia, Leishmania, flebotomus, Phlebotomus, Lutzomyia, tiplíci, Culicoides
• Klíčová slova anglicky: Mundinia, Leishmania, sand fly, Phlebotomus, Lutzomyia, biting midges, Culicoides
• Akademický rok vypsání: 2023/2024
• Typ práce: rigorózní práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Katedra parazitologie (31-161)
• Řešitel: skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 15.04.2024
• Datum zadání: 15.04.2024
• Datum potvrzení stud. oddělením: 13.05.2024
• Datum odevzdání elektronické podoby: 15.04.2024
• Datum proběhlé obhajoby: 24.05.2024

Předběžná náplň práce

Tématem dizertační práce bude studium biologie leishmanií podrodu Mundinia se zaměřením na zavedení modelového zvířete pro výzkum těchto leishmanií a laboratorní testování potencionálních přenašečů. Dizertační práce si klade za cíl doplnění mezer ve znalostech o biologii těchto cizopasníků.

A) Zavedení laboratorního modelu pro výzkum L. (Mundinia).

Vhodné modelového zvíře by mělo vykazovat obdobné patologické rysy onemocnění a imunitní odpověď vůči danému druhu leishmanií, jako je tomu u člověka. Imunitní odpověď na stejný druh leishmanie je však u různých hostitelů značně rozdílná a mechanismy, které fungují u zdánlivě standardního modelu inbredních kmenů myší, nemají zdaleka univerzální platnost. Proto je jedinou cestou, jak najít vhodný zvířecí model, studium většího spektra potenciálních modelových organismů.

Dílčí cíle:
• Experimentální infekce myší kmene BALB/c Tento imunodeficientní kmen myší je nejčastěji používaným modelovým zvířetem pro výzkum leishmanií, především L. major. Jeho výhodou je snadný chov, komerční dostupnost a kontrolované a shodné genetické pozadí (inbrední chov).
• Experimentální infekce křečíků (Cricetulus griseus) a pestrušek (Lagurus lagurus). Tyto druhy divokých hlodavců jsou naopak geneticky polymorfní a umožní modelovat odpověď potencionálního přirozeného hostitele leishmanií s přirozenou dynamiku infekcí. V našich předchozích pokusech jsme prokázali vnímavost křečíků a pestrušek vůči různým druhům leishmanií podrodu Leishmania a Viannia. Navíc jsou to zvířata snadno chovatelná a komerčně dostupná.
• U všech těchto modelových organismů budeme sledovat dynamiku infekcí (tvorba kožních lézí, změna hmotnosti, distribuce parazita v těle hostitele) a infektivitu pro přenašeče (xenodiagnostické pokusy).

B) Srovnání vývoje L. (Mundinia) v různých druzích hmyzích přenašečů.

Hmyzí přenašeči dosud nejsou definitivně prokázáni u žádného druhu L. (Mundinia). Zatímco leishmanie ostatních podrodů jsou přenášeny flebotomy (Diptera: Phlebotominae), jedinými dosud téměř prokázanými přenašeči leishmanií z podrodu Mundinia jsou tiplíci (Diptera: Ceratopoginidae) v případě australské L. macropodum. Proto se nabízí testovat vývoj leishmanií tohoto podrodu nejen ve flebotomech, ale i v tiplících.

Dílčí cíle:
• Experimentální infekce flebotomů. Využijeme druhy flebotomů žijící v endemických lokalitách výskytu daných leishmanií, které máme k dispozici v insektáriu katedry parazitologie (rod Lutzomyia, Phlebotomus, Sergentomyia).
• Experimentální infekce tiplíků. Pro testování vývoje v tiplících využijeme spolupráci s Pirbright Institute (UK), se kterým máme v rámci projektu Infravec 2 dohodnuté zásilky druhu Culicoides sonorensis.
• Budeme hodnotit intenzitu a lokalizace infekcí, zastoupení morfologických forem leishmanií a v případě úspěšné infekce přenašeče provedeme i experimentální přenos na hostitele.

Způsob řešení:
A) Zavedení laboratorního modelu pro výzkum L. (Mundinia).

Kultivace leishmanií
Leishmanie jsou dlouhodobě uchovávané v kryobance v zamražovacích ampulích CryoTube™ Vials (NUNC) v médiu obsahujícím 7% DMSO (Sigma-Aldrich). Před použitím jsou buňky rozmraženy a přeočkovány do tekutého kultivačního média M199 (Sigma) s přidáním 10% FCS (Gibco), 1% BME vitamínů (Sigma), 2% sterilní lidskou močí and 250 μg/ml amikacinu (Amikin, Bristol-Myers Squibb). a kultivovány při 23-26 °C (dle druhu) v plochých kultivačních zkumavkách.

Chov flebotomů
Kolonie jsou chovány ve speciálních prostorách insektária, určených výhradně k tomuto účelu. Jedná se o místnosti s trvale udržovanou vlhkostí 50 % a teplotou 25 °C. Fotoperioda je 14 hodin světla a 10 hodin tmy. Dospělci jsou chováni v nylonových sítích uvázaných na kovových konstrukcích, které jsou umístěné v plastových pytlích. Uvnitř pytle je umístěna vata navlhčená destilovanou vodou, která udržuje vlhkost v pytli na ideálních 75-90 %.
Dospělci jsou krmeni 50% roztokem sacharózy. Kousek vaty nasáklý tímto roztokem je umístěn v malé skleněné Petriho misce na dně sítě. Dospělci jsou vypouštěni 3x týdně, samice staré minimálně 2 dny (dle individuálních specifik každého druhu) jsou sáty na uspané BALB/c myši (AnLab, s.r.o.) nebo na neuspaném Novozélandském bílém králíkovi (NZW, Velaz, s.r.o.) umístěném ve fixačním postroji. Dva až pět dnů po sání jsou nasáté samice přemístěny do vlhčených, sádrou vylitých kelímků, ve kterých dochází ke kladení vajec. Kelímky jsou umístěny do plastových boxů s vlhčenou písčitou podestýlkou sloužící k udržení ideální vlhkosti uvnitř chovných boxů. Zhruba po týdnu se z vajec začínají líhnout larvičky L1, které se postupně vyvinou až do stádia L4, které se posléze zakuklí a zhruba po týdnu začnou z kukel vyletovat dospělci. Celý cyklus trvá 5-8 týdnů. Larvičky jsou 3x týdně krmeny jemně namletou fermentovanou směsí králičího trusu a granulí. K fermentaci dochází v uzavřených kovových bednách při teplotě 23-25 °C a vysoké vzdušné vlhkosti udržované přítomností táců s vodou uvnitř beden (Volf a Volfová 2011).

Chov hlodavců
Během práce budou použity 3 druhy hlodavců – Mus musculus (BALB/c), Cricetulus griseus a Lagurus lagurus. Zvířata pro pokus budou umístěna v akváriích typu T4 (58 x 37 x 20 cm, Velaz) s podestýlkou z neprašných pilin a neprašného sena. Hlodavci budou mít nepřetržitý přístup k čisté pitné vodě ve skleněné napáječce a budou krmeni standardní krmnou směsí ST-1 (Velaz) doplněnou čerstvou zeleninou. V chovné místnosti bude udržována konstantní teplota 20-24 °C a vlhkost 45-50 %.
Experimentální infekce hlodavců
Leishmanie ze stacionární fáze růstu kultury budou promyty ve sterilním fyziologickém roztoku a spočítány. Hlodavci (stejného pohlaví a stáří) budou experimentálně nakaženi intradermální inokulací ušních boltců 1x107 leishmanií v 5 µl fyziologického roztoku.
Bude vytvořeno 8 skupin po pěti jedincích infikovaných jednotlivými druhy/izoláty L. (Mundinia) a kontrolní skupina, které bude do ucha inokulován pouze fyziologický roztok. Dva jedinci z každé skupiny budou testováni každých 5 týdnů pomocí xenodiagnostiky. V průběhu celého pokusu bude u všech zvířat zaznamenáván jejich zdravotní stav a vnější manifestace onemocnění (hmotnost, kvalita srsti, velikost případných lézí). Na konci pokusu (25. týden p.i.) budou zvířata usmrcena a bude jim odebrána krev a tkáně (ušní boltce, spádové uzliny, tlapky, ocas, slezina, játra) pro kvantitativní stanovení parazitů pomocí qPCR. S každým druhem hlodavce bude pokus jednou opakován.

Xenodiagnostika
Hlodavci budou na jednu hodinu uvedeni do anestezie pomocí roztoku ketaminu a xylazinu a vloženi do síťky s 40 samicemi flebotomů. Flebotomům bude umožněno sát pouze na infikovaném ušním boltci, zbytek těla hlodavců bude zakryt plátěným sáčkem. Nasáté samice flebotomů budou 2. den po sání vyšetřeny pomocí PCR na přítomnost leishmanií (v poolech po pěti).

Kvantitativní PCR
Pro detekci leishmanií v tkáních a flebotomech bude použita metoda qPCR s vlastními primery navrženými za pomoci programů BLAST, MEGA (ClustalW) a Primer-BLAST. Primery cílí na 246 bp dlouhý úsek DNA v sekvenci ITS-1 malé ribozomální podjednotky konzervovaný skrz všechny známé podrody leishmanií (alignment byl vytvořen pro 36 druhů). Sekvence primerů je: forward primer - 5´-CTTTTCTGGTCCTCCGGGTAGG-3´ a reverse primer - 5´ CCACCCGGCCCTATTTTACACCAA-3´. Pro detekci a kvantifikaci leishmaniové DNA je využito měření fluorescence při navázání barvy SYBR Green (SsoAdvancedTM Universal SYBR®, Bio-Rad) na dvouvláknový produkt na přístroji iQ5 real-time PCR Detection system (Bio-Rad) dle protokolu 1. 98 °C/2:30 min, 2. 98 °C/10 vteřin, 3. 60 °C/30 vteřin. Body 2 a 3 jsou opakovány 40x a po skončení bodu 3 je vždy měřena fluorescence.

Časový plán pokusů:
První rok – experimentální infekce myší BALB/c
Druhý rok – experimentální infekce pestrušek
Třetí rok – experimentální infekce křečíků

B) Srovnání vývoje L. (Mundinia) v různých druzích hmyzích přenašečů.

Experimentální infekce hmyzu
Promastigoti leishmanií z log-fáze kultury budou promyti ve sterilním fyziologickém roztoku, spočítáni a smícháni s inaktivovanou (35 min/56 °C) defibrinovanou králičí krví na výslednou koncentraci 106 buněk/ml. Tato suspenze bude podávána samicím ve skleněném krmítku přes membránu tvořenou sterilní kuřecí kůži, připevněnou ke krmítku pomocí parafilmu. Krmítko zahřívané na 37 °C průtokem ohřáté vody bude umístěno do malé sítě (20x20x20 cm) se 150 samicemi flebotomů nebo tiplíků. Sání bude probíhat 2 hodiny v přítmí při teplotě v místnosti mezi 25–27 °C (v závislosti na druhu hmyzu) a po ukončení saní budou nenasáté samice odebrány ze sítě pomocí exhaustoru.

Hodnocení infekcí
Nasáté samice budou pitvány ve třech časových intervalech po sání, první pitvy (den 1-2) slouží pro ověření úspěšnosti experimentální infekce, další (den 3-6) pro posouzení stavu infekce po defekaci samic a poslední (den 8-10) pro zhodnocení zralé infekce. Samice budou uspány na ledu, přeneseny do kapky sterilního fyziologického roztoku, pod binokulární lupou dekapitovány a pomocí ostré entomologické pinzety a minucie bude separováno střevo, které bude následně přeneseno do nové kapky sterilního fyziologického roztoku a prohlédnuto pod světelným mikroskopem. Intenzita infekce střeva bude hodnocena dle Myšková et al. (2008) jako slabá (méně než 100 buněk/střevo), střední (100-1000 buněk/střevo) a silná (více než 1000 buněk/střevo), zároveň bude popsána lokalizace leishmanií ve střevě dle Sádlová et al. (2010) (stomodeální valva, thorakální mezenteron, abdominální mezenteron a v případě přítomnosti peritrofické matrix u nevydefekovaných samic endoperitrofický prostor).

Morfologie leishmanií
Měření leishmanií použitých pro infekce hlodavců a leishmanií ze střev nakažených flebotomů bude prováděno především s cílem zjistit zastoupení metacyklických forem. Roztěry budou připraveny ze střev nakažených samic a po zaschnutí fixovány 5 minut metanolem a následně 20 minut barveny Giemsou (Sigma; ředění v poměru 1:19 dH2O). Prohlížení preparátů bude prováděno pod světelným mikroskopem (Olympus BX51) se zabudovanou kamerou (DP-70) při zvětšení 1000x za použití imerzního oleje. Leishmanie budou snímány v programu QuickPHOTO MICRO 2.2 (Olympus) a následně budou jejich rozměry měřeny v programu ImageJ (Java). Vždy bude měřeno alespoň 200 leishmanií pocházejících z různých flebotomů. Data jsou následně statisticky vyhodnocena v programu SPSS. 27. Jednotlivé morfologické formy budou rozlišovány podle kritérií stanovených v Sádlová a kol. (2010).

Přenos leishmanií na hostitele
Přenosové pokusy umožňují otestovat celý koloběh onemocnění mezi hostitelem a přenašečem. Jedná se o experimentální přenos infekce sáním infikovaného hmyzího přenašeče na naivním hostiteli a následnou reinfekci naivního přenašeče sáním na takto nakaženém hostiteli. Pokud se ukáže, že se v některém z testovaných druhů přenašečů vyvíjí některý z druhů L. (Mundinia), budou samice flebotomů nebo tiplíků experimentálně infikovány leishmaniemi sáním přes membránu (podrobně popsáno výše). Po vyvinutí zralé infekce ve střevě přenašečů (8. -12. den po nakažení) umožníme samicím sání na uspaném naivním hlodavci. Hlodavci budou následně každých 5 týdnů vystaveni sání neinfikovaných samic flebotomů. Nasáté samice flebotomů budou po 8 dnech vypitvány a jejich střeva mikroskopicky vyšetřena na přítomnost leishmanií.
Časový plán pokusů:
První rok – experimentální infekce flebotomů
Druhý rok – experimentální infekce tiplíků
Třetí rok – přenosové pokusy