Subtypes of NG2-expressing cells in mesenchyme of healthy gut and intestinal tumors

• Název práce v češtině: Subtypy NG2 exprimujících buněk v mesenchymu zdravého střeva a střevních nádorů
• Název v anglickém jazyce: Subtypes of NG2-expressing cells in mesenchyme of healthy gut and intestinal tumors
• Klíčová slova: Střevní epitel, rakovina tlustého střeva, chondroitin sulfát proteoglykan 4, perivaskulární buňky, perikryptové buňky
• Klíčová slova anglicky: Intestinal epithelium, colorectal cancer, chondroitin sulfate proteoglycan 4, perivascular cells, pericryptal cells
• Akademický rok vypsání: 2023/2024
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Katedra buněčné biologie (31-151)
• Vedoucí / školitel: Mgr. Lucie Janečková, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 03.10.2023
• Datum zadání: 03.10.2023
• Datum potvrzení stud. oddělením: 16.01.2024
• Datum odevzdání elektronické podoby: 29.04.2025
• Datum proběhlé obhajoby: 03.06.2025
• Oponenti: Mgr. Jolana Turečková, Ph.D.

Předběžná náplň práce

Střevní epitel, jedna z nejrychleji se obnovujících tkání v lidském těle, vděčí za svou pozoruhodnou regenerační schopnost vysoce aktivním střevním kmenovým buňkám. Rychlá obměna však také koreluje s relativně vysokým výskytem nádorového bujení v této tkáni. Zatímco střevní epitel byl dlouho a podrobně studován a mnoho je známo o jeho obnově, mezenchym střeva je překvapivě méně zkoumán, ačkoli buňky přítomné v něm přímo ovlivňují homeostázu epitelu. Buňky nesoucí neural-glial antigen 2 (NG2) a receptor gůstového faktoru krevních destiček A (Pdgfra) exprimují signální molekuly, které přímo ovlivňují proliferaci a diferenciaci buněk střevního epitelu. Marker NG2 navíc v mnoha tkáních označuje pericyty známé tím, že tvoří komunikační most mezi endotelem krevních cév a okolní tkání, jejich působení má také přímý vliv na angiogenezi. V souvislosti se střevními adenomy ukázaly nedávné práce významný vliv tzv. stroma také na růst nádoru.
Cílem této studie je charakterizovat subtypy NG2 buněk v mezenchymu střeva, určit jejich přesné umístění a identifikovat markery charakteristické pro každou subpopulaci. K dosažení tohoto cíle použijeme reportérové myši NG2CreER^TMBAC:Rosa26-tdTomato:Pdgfrα-EGFP, které nám umožní vizualizovat NG2 buňky ve střevním mezenchymu. Pomocí buněk označených červeným fluorescenčním proteinem tdTomato a provedením imunofluorescenčního barvení specifických markerů rozeznáme množství a lokalizaci různých subtypů NG2 buněk (předpokládáme možnost rozeznat přinejmenším perivaskulární a perikryptové buňky) jak ve zdravém střevním mezenchymu, tak v indukovaných střevních nádorech. Dále budeme izolovat tyto subpopulace NG2 buněk pomocí průtokové cytometrie (Fluorescent Activated Cell Sorting, FACS) a ověříme expresi genů specifických pro každou subpopulaci. Budeme také analyzovat expresi cílových genů kanonické signální dráhy Wnt. Za předpokladu, že tato dráha bude v NG2 buňkách aktivní, plánujeme její aktivitu modifikovat s použitím myších kmenů umožňujících tkáňově specifickou upregulaci či downregulaci dráhy Wnt/β-catenin. Následně budeme zkoumat dopad modulace dráhy Wnt na četnost a specifickou genovou expresi subtypů NG2 buněk.
Na rozdíl od vysoce dynamické povahy střevního epitelu může mít ovlivňování mezenchymálních buněk ve střevě trvalejší účinky. Předpokládáme, že tato práce poskytne základ pro pochopení toho, jak by bylo možné růst střevních nádorů omezit skrze modulaci mezenchymálních buněk.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

The intestinal epithelium, one of the most rapidly renewing tissues in the human body, owes its remarkable regenerative capacity to the highly active intestinal stem cells. However, the fast turnover also correlates with a relatively high incidence of tumorigenesis within this tissue. While extensive research has shed light on the mechanisms governing the renewal of the intestinal epithelium, the mesenchyme of the intestine remains comparatively understudied, despite its significant role in influencing epithelial homeostasis. A subset of cells expressing neural-glial antigen 2 (NG2) and platelet-derived growth factor alpha (Pdgfra) plays a pivotal role by releasing signaling molecules that directly impact cell proliferation and differentiation. Additionally, NG2 is a marker found in many tissues, signifying the presence of pericytes, which are recognized for their role in facilitating communication between the blood vessel endothelium and the surrounding tissue, ultimately influencing angiogenesis. In the context of intestinal adenomas, emerging evidence underscores the substantial influence of the tumor stroma on tumor growth.
The objective of our study is to categorize the various subtypes of NG2 cells in the intestinal mesenchyme, pinpoint their precise locations, and identify characteristic markers for each subpopulation. To achieve this, we will employ NG2CreER^TMBAC:Rosa26-tdTomato:Pdgfrα-EGFP reporter mice, enabling us to visualize NG2 cells within the intestinal mesenchyme. Using NG2-tdTomato-labeled cells with red fluorescent protein and conducting immunofluorescent staining of specific markers, we will discern the abundance and localization of different NG2 cell subtypes (with an expectation to distinguish at least perivascular cells and pericrypt cells) in both healthy intestinal mesenchyme and induced intestinal tumors. Furthermore, we will isolate these NG2 cell subpopulations through flow cytometry (Fluorescent Activated Cell Sorting, FACS) and validate the expression of genes specific to each subpopulation. We will also analyze the expression of the canonical Wnt signaling pathway responsive genes. Assuming that the Wnt pathway is active in NG2 cells, we plan to manipulate its activity using mouse strains that allow tissue-specific upregulation or downregulation of the Wnt/β-catenin pathway. Subsequently, we will examine the impact of the Wnt pathway modulation on the frequency and gene expression profiles of NG2 cell subtypes.
In contrast to the highly dynamic nature of the intestinal epithelium, influencing mesenchymal cells within the intestine may exert more enduring effects. We anticipate that this work will provide a basis for understanding how the growth of intestinal tumors might be reduced by modulating of mesenchymal cells.