CRL4DCAF12 Ubiquitin Ligase: A Novel Factor in DNA Replication Control

• Název práce v češtině: Ubikvitin ligáza CRL4^DCAF12: Nový faktor kontroly replikace DNA
• Název v anglickém jazyce: CRL4^DCAF12 Ubiquitin Ligase: A Novel Factor in DNA Replication Control
• Klíčová slova: ubikvitin ligáza, DCAF12, MCM, MCMBP, replikace
• Klíčová slova anglicky: ubiquitin ligase, DCAF12, MCM, MCMBP, replication
• Akademický rok vypsání: 2022/2023
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Katedra buněčné biologie (31-151)
• Vedoucí / školitel: Mgr. Lukáš Čermák, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 27.10.2022
• Datum zadání: 27.10.2022
• Datum potvrzení stud. oddělením: 27.01.2023
• Datum odevzdání elektronické podoby: 11.12.2024
• Datum proběhlé obhajoby: 28.01.2025
• Oponenti: RNDr. David Drutovič, Ph.D.
• Ocenění: Práce byla navržena na ocenění

Předběžná náplň práce

Cílem této práce je charakterizovat nové substráty ubikvitinových ligáz a fyziologické aspekty jejich degradace. Ubikvitinové ligázy nejsou zodpovědné pouze za cílenou ubikvitinaci a degradaci nepotřebných nebo poškozených proteinů. Jejich funkce je nezbytná také v řadě buněčných procesů, jako je zesilování signálů iniciovaných extracelulárními podněty, cyklické procesy zodpovědné za buněčné dělení nebo biochemické dráhy zodpovědné za správný cirkadiánní rytmus, replikace DNA, odstraňování denaturovaných proteinů, opravy poškození DNA a další. Inaktivace nebo nesprávná regulace jejich funkce často vede k rozvoji neurodegenerativních a nádorových onemocnění.
Náš projekt má několik cílů. Budeme analyzovat regulaci degradace vybraných substrátů ubikvitinové ligázy CRL4-DCAF12 pomocí western blotu. Následně budeme analyzovat úlohu těchto substrátů a jejich degradace během buněčného cyklu. Kromě western blotu, imuno- a afinitní purifikace použijeme také analýzy pomocí FACS ke sledování buněčného cyklu, jakož i aktivace nebo inhibice buněčné smrti/apoptózy. Důležitou součástí mé práce bude příprava myšího kmene s deficitem exprese Dcaf12 a p53. U těchto myší budeme sledovat morfologické, fyziologické a patologické charakteristiky, zejména vývoj nádorů a s ním spojené přežívání. Související metody průběžně používané v našem projektu se budou týkat analýzy genové exprese, udržování a generování myších kmenů (genotypování), imunohistochemické a imunofluorescenční analýzy tkáňových řezů, a práce se softwarem pro kontrolu myší kolonie (Pyrat). Mimo jiné budeme využívat metody závislé na PCR a qPCR, mutagenezi in vitro, transfekci a selekci eukaryotických buněk, izolaci proteinů, bakteriální transformaci, purifikaci DNA a RNA a přípravu rekombinantní DNA.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

The aim of this work is to characterize new substrates of ubiquitin ligases and physiological aspects of their degradation. Ubiquitin ligases are not only responsible for targeted ubiquitination and degradation of unnecessary or damaged proteins. Their function is also essential in a number of cellular processes, such as amplification of signals initiated by extracellular stimuli, cyclic processes responsible for cell division or biochemical pathways responsible for proper circadian rhythm, DNA replication, removal of denatured proteins, repair of DNA damage, and others. Inactivation or misregulation of their function often leads to the development of neurodegenerative and cancer diseases.
Our project has several goals. We will analyze the regulation of degradation of selected substrates of the ubiquitin ligase CRL4-DCAF12 by western blot. Subsequently, we will analyze the role of these substrates and their degradation during the cell cycle. In addition to western blot, immuno and affinity purification, we will also use FACS analyses to monitor cell cycle as well as activation or inhibition of cell death/apoptosis. An important part of my work will be to prepare a mouse strain deficient in Dcaf12 and p53 expression. In these mice we will monitor morphological, physiological and pathological characteristics, in particular tumor development and associated survival. Related methods continuously used in our project will involve gene expression analysis, maintenance and generation of mouse strains (genotyping), immunohistochemical and immunofluorescence analysis of tissue sections, and working with mouse colony control software (Pyrat). Among other things, we will be using methods such as PCR and qPCR, in vitro mutagenesis, transfection and selection of eukaryotic cells, protein isolation, bacterial transformation, DNA and RNA purification, and recombinant DNA preparation.