Exploration of tryptophan in/dispensability in Escherichia coli by recombineering

• Název práce v češtině: Recombineering v Escherichii coli, jako nástroj pro výzkum postradatelnosti tryptofanu
• Název v anglickém jazyce: Exploration of tryptophan in/dispensability in Escherichia coli by recombineering
• Klíčová slova: Postradatelnost aminokyselin, Evoluce genetického kódu, Tryptofan, Recombineering, Genomové inženýrství
• Klíčová slova anglicky: Amino acid dispensability, Evolution of genetic code, Tryptophan, Recombineering, Genome engineering
• Akademický rok vypsání: 2022/2023
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
• Vedoucí / školitel: Mgr. Klára Hlouchová, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 24.10.2022
• Datum zadání: 24.10.2022
• Datum potvrzení stud. oddělením: 27.01.2023
• Datum odevzdání elektronické podoby: 08.08.2024
• Datum proběhlé obhajoby: 12.09.2024
• Oponenti: Mgr. Jan Pačes, Ph.D.

Předběžná náplň práce

Cílem diplomového projektu je konstrukce (pomocí in vivo recombineeringu) esenciální metabolické dráhy, jejíž proteiny budou sestaveny pouze 19 aminokyselinami. Experiment je založen na hypotéze, že dávný buněčný život, předcházející nebo současný poslednímu universálnímu společnému předkovi (LUCA), využíval menší počet, než současných 20 kanonických aminokyselin. Aminokyselinou zájmu je především tryptofan, u kterého je předpokládáno, že se stal jedním z posledních přírůstků do aminokyselinové abecedy. Tryptofan je po cysteinu druhou nejméně zastoupenou aminokyselinou v proteomu E. coli i většiny dalších organismů a je kódován pouze jedním tripletem. Předpokládá se, že tryptofan (společně s dalšími „mladými“ aminokyselinami) byl počátečně syntetizován proteiny dávného organismu, které tuto aminokyselinu neobsahovaly.
Pro experimentální posouzení těchto předpokladů bude diplomová práce testovat, zda lze vyměnit všechny tryptofanové zbytky v proteinech biosyntetické dráhy tryptofanu za jiné aminokyseliny. Student/ka nejprve analyzuje pozice tryptofanu v těchto proteinech pro jejich strukturální a funkční roli pomocí strukturní bioinformatiky. Poté navrhne oligonukleotidy pro in vivo recombineering, který umožňuje kombinatoricky vyměnit tryptofanový kodón za náhodný triplet, kódující jinou aminokyselinu. Součástí práce bude i optimalizace celého protokolu a případné změny ve strategii. Život-umožňující substituce budou charakterizovány sekvenací, a případné růstové odchylky E. coli budou zaznamenány.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

The aim of this thesis project is to engineer (using in vivo recombineering) an essential metabolic pathway to use only 19 amino acids to build all its proteins. The experiment is based on a rationale that earlier organisms, around the time or preceding the Last Universal Common Ancestor, used less amino acids than life bears in extant genetic coding system. Of particular interest is tryptophane which is thought to be among the last additions to the amino acid alphabet. Besides cysteine, tryptophane is the least represented amino acid in E. coli and most other proteomes, translated by a single codon. It is assumed that tryptophane (among other “young” amino acids) was initially synthesized by early organisms using proteins lacking this residue.
To experimentally address this chicken-and-egg problem, this thesis will test if all tryptophane residues of the E. coli Trp biosynthetic pathway can be substituted by other amino acids. The student will first analyze all the Trp positions of the pathway and evaluate their structural/functional roles, using structural bioinformatics. He/she will design recombineering oligonucleotides to randomize individual Trp positions by all possible substitutions and perform the in vivo genetic engineering sequentially, optimizing the protocol on the way and re-designing the strategy if needed. The viable substitutions will be characterized by sequencing the selected variants and any E. coli growth deficiencies will be characterized.