Spektroskopická analýza karotenoidů v živých organismech

• Název práce v češtině: Spektroskopická analýza karotenoidů v živých organismech
• Název v anglickém jazyce: Spectroscopic analysis of carotenoids in living organisms
• Klíčová slova: karotenoidy|zelená autofluorescence|Ramanova mikroskopie|fluorescenční mikroskopie|mikroorganizmy|mikroskopické řasy|buňky|biologické tkáně
• Klíčová slova anglicky: carotenoids|green autofluorescence|Raman microscopy|fluorescence microscopy|microorganisms|microalgae|cells|biological tissues
• Akademický rok vypsání: 2021/2022
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Fyzikální ústav UK (32-FUUK)
• Vedoucí / školitel: doc. RNDr. Peter Mojzeš, CSc.
• Řešitel: skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 02.01.2022
• Datum zadání: 03.01.2022
• Datum potvrzení stud. oddělením: 12.01.2024
• Konzultanti: RNDr. Ing. Jana Pilátová, Ph.D.

Zásady pro vypracování

1. Seznámit se s problematikou spektrálních vlastností karotenoidů, jejich výskytu a funkcí v živých organismech a současný stav poznání přehledně shrnout v literární rešerši.
2. Seznámit se s metodou Ramanovy spektroskopie a zvládnout měření na Ramanově mikroskopu, snímání na fluorescenčním mikroskopu, popř. fluorimetru či skenovacím fluorescenčním konfokálním mikroskopu s FLIM detekcí.
3. Připravit vzorky standardů vybraných karotenoidů v různě polárních rozpouštědlech a změřit jejich emisní a excitační spektra.
4. Proměřit, zpracovat a interpretovat emisní a Ramanova spektra připravených standardů a biologického materiálu a interpretovat pozorování.
5. Na základě teoretických znalostí a empirických měření kriticky zhodnotit hypotetickou roli spektrálních projevů karotenoidů jako zdroje „zelené autofluorescence“ biologických objektů.

Seznam odborné literatury

1. Dieing, T., Hollricher, O., & Toporski, J. (2011). Confocal Raman Microscopy, Springer, Heidelberg.
2. Tang, Y. Z., & Dobbs, F. C. (2007). Green autofluorescence in dinoflagellates, diatoms, and other microalgae and its implications for vital staining and morphological studies. Applied and Environmental Microbiology, 73(7), 2306-2313.
3. Khandelwal, S., & Saxena, R. K. (2007). Age-dependent increase in green autofluorescence of blood erythrocytes. Journal of Biosciences, 32(2), 1139-1145.
4. Mihalcescu, I., Gateau, M. V. M., Chelli, B., Pinel, C., & Ravanat, J. L. (2015). Green autofluorescence, a double edged monitoring tool for bacterial growth and activity in micro-plates. Physical Biology, 12(6), 066016.
5. Gillbro, T., & Cogdell, R. J. (1989). Carotenoid fluorescence. Chemical Physics Letters, 158(3-4), 312-316.
6. Andersson, P. O., Gillbro, T., Ferguson, L., & Cogdell, R. J. (1991). Absorption spectral shifts of carotenoids related to medium polarizability. Photochemistry and Photobiology, 54(3), 353-360.
7. Kloz, M., Weißenborn, J., Polívka, T., Frank, H. A., & Kennis, J. T. (2016). Spectral watermarking in femtosecond stimulated Raman spectroscopy: resolving the nature of the carotenoid S* state. Physical Chemistry Chemical Physics, 18(21), 14619-14628.
8. Chisté, R. C., Freitas, M., Mercadante, A. Z., & Fernandes, E. (2014). Carotenoids inhibit lipid peroxidation and hemoglobin oxidation, but not the depletion of glutathione induced by ROS in human erythrocytes. Life Sciences, 99(1-2), 52-60.
9. Strati, I. F., & Oreopoulou, V. (2011). Effect of extraction parameters on the carotenoid recovery from tomato waste. International Journal of Food Science & Technology, 46(1), 23-29.
10. Jehlička, J., Edwards, H. G., Osterrothová, K., Novotná, J., Nedbalová, L., Kopecký, J., & Oren, A. (2014). Potential and limits of Raman spectroscopy for carotenoid detection in microorganisms: implications for astrobiology. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences, 372(2030), 20140199.
11. Rygula, A., Oleszkiewicz, T., Grzebelus, E., Pacia, M. Z., Baranska, M., & Baranski, R. (2018). Raman, AFM and SNOM high resolution imaging of carotene crystals in a model carrot cell system. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 197, 47-55.

Předběžná náplň práce

Karotenoidy jsou jednou z nejčastěji se vyskytujících biomolekul v živých organismech od bakterií po savce. Mají rozličné funkce – od světlosběrných antén v chloroplastech rostlin a řas přes fotosenzorické pigmenty nezbytné pro naše vidění po antioxidanty. V závislosti na funkci je také jejich lokalizace v buňkách a subcelulárních kompartmentech odlišná. Karotenoidy mají extrémně silný signál Ramanova rozptylu i mimo oblast rezonančního zesílení díky velmi efektivními ramanovskému průřezu. Zároveň v literatuře panuje nesoulad ohledně dalších spektrálních vlastností přisuzovaných v biologických článcích fluorescenci, zatímco fyzikálně zaměřené články fluorescenci rezolutně vylučují s ohledem na zakázané energetické přechody nutné pro excitaci valenčních elektronů. Dále zatím není obecně rozšířené povědomí o původu „zelené autofluorescence“ u celé řady organismů včetně lidských buněčných linií a vzorků tkání, kde se dokonce využívá jako „proxy“ při stárnutí nebo progresi patologických nálezů. Naše dosavadní pozorování nasvědčuje tomu, že molekulární podstatou těchto dosud neinterpretovaných dat je právě přítomnost karotenoidů, jejichž spektrální vlastnosti se liší v závislosti na chemickém prostředí, zejména polaritě rozpouštědla, což bude předmětem zkoumání této práce. Práce bude mít za cíl systematicky revidovat spektrální chování karotenoidů jako čisté látky a také přímo in vivo a in situ v živých buňkách. Potřebný materiál a experimentální vybavení v podobě Ramanova mikroskopu, Ramanova spektroskopu, fluorimetru a FLIM mikroskopie jsou k dispozici. Diplomová práce bude součástí grantového projektu GAČR, ze kterého bude řešiteli diplomové práce poskytnuta finanční podpora. Výsledky práce budou prezentovány na konferencích a publikovány jako vědecký článek.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Carotenoids are one of the most common biomolecules in living organisms from bacteria to mammals. Among their various functions, carotenoids act as a part of light-harvesting antennas in the chloroplasts of plants and algae, the photosensory pigments necessary for our vision, or important antioxidants. Depending on their function, their location in cells and subcellular compartments varies. Carotenoids have an extremely intense signal of Raman scattering without resonance due to very efficient Raman cross-sections of their conjugated bonds. Furthermore, there is a discrepancy in the literature regarding their spectral properties attributed to fluorescence in biological samples, while physically oriented publications exclude fluorescence due to the forbidden energy transitions necessary for the excitation of valence electrons. Besides, there is no widespread awareness of the origin of "green autofluorescence" in many organisms, including human cell lines and tissue samples, where it is even used as “a proxy” in the aging or progression of pathological findings. Our observations to date suggest that the molecular basis of these as yet uninterpreted data is the presence of carotenoids, whose spectral properties vary depending on the chemical environment, especially the polarity of the solvent, which will be the subject of this work. The thesis project should aim to systematical revision of the spectral behavior of carotenoids as pure substances and also directly in vivo and in situ in living organisms. Working material and experimental equipment in the form of Raman microscope, Raman spectroscope, fluorimeter and FLIM microscopy are available. The diploma thesis will be a part of the GAČR grant project that will bring a financial benefit to the student. The results of the work will be presented at conferences and published as a scientific article.