Role komplexu ARP2/3 v regulaci sekrece účastnící se syntézy buněčné stěny

• Název práce v češtině: Role komplexu ARP2/3 v regulaci sekrece účastnící se syntézy buněčné stěny
• Název v anglickém jazyce: ARP2/3 control of regulation of plant cell wall secretion
• Klíčová slova: ARP2/3, aktin, buněčná stěna, sekretorická dráha
• Klíčová slova anglicky: ARP2/3, actin, cell wall, secretory pathway
• Akademický rok vypsání: 2021/2022
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra experimentální biologie rostlin (31-130)
• Vedoucí / školitel: RNDr. Kateřina Schwarzerová, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 12.10.2021
• Datum zadání: 12.10.2021
• Konzultanti: prof. RNDr. Viktor Žárský, CSc.

Předběžná náplň práce

Téma disertace vychází jednak z dlouhodobého výzkumného zaměření laboratoře, a jednak z diplomové práce studentky. Hlavním cílem disertace je nalézt přímé buněčné cíle regulační role komplexu Arp2/3, které vedou ke správné depozici buněčné stěny.
GA je zdrojem polysacharidů buněčné stěny a též enzymů pro syntézu celulózy a kalózy, a tyto molekuly jsou dopravovány k plazmatické membráně ve formě váčků. Zde jsou exocytovány do prostoru buněčné stěny. V disertaci se bude proto studentka věnovat především oblasti kortikální cytoplazmy a post-GA kompartmentům a pokusí se najít konkrétní okamžik, kde komplex Arp2/3 moduluje depozici buněčné stěny. Hlavním modelovým materiálem bude Arabidopsis thaliana, především buňky hypokotylu (pletivo s popsaným fenotypem – poškození adheze buněk v případě nefunkčního Arp2/3 komplexu).
Prvním přístupem je ko-lokalizace komplexu Arp2/3 se značenými podjednotkami (GFP, RFP)s vybranými komponentami výše popsané mašinérie. Pro prokázání interakce mezi ARPC2-GFP a EXO84b-RFP, poprvé popsané v diplomové práci studentky, bude použitsplit-YFP systém a FRET, případněmetoda FLIM/FRET, která umožňuje vysoké prostorové i časové rozlišení snímaných objektů.
Dále bude testovánainterakce mezi podjednotkami Arp2/3 a dalšími vybranými podjednotkami Exocystu, zejména EXO70. Hlavním metodickým přístupem bude TIRF/VAEM mikroskopie, případně FLIM/FRET mikroskopie a biochemické potvrzení pomocí ko-imunoprecipitace. Pokud bude interakce potvrzena, bude studována dynamika komplexu Arp2/3 v mutantech postrádajících dané podjednotky Exocystu. (Dynamika EXO84b proteinu v rostlinách postrádajících funkční komplex Arp2/3 bude součástí DP dalšího studenta).
Vzhledem k tomu, že mutanti postrádající vybrané proteiny fungující v dráze mezi GA a plazmatickou membránou vykazují velmi podobné fenotypy jako mutanty postrádající funkční Arp2/3 komplex, budou připraveny FP-fúze vybraných proteinů a bude studována interakce mezi těmito proteiny a Arp2/3. Metodické přístupy budou zahrnovat mikroskopii a biochemické metody ko-imunoprecipitace. S buněčnou stěnou souvisí i další experiment, ve kterém budou konstruovánídvojití mutantipodjednotek Exocystu a Arp2/3 za účelem studia změn buněčné stěny, především stěny trichomů (single mutanty vykazují specifické změny v konstrukci trichomů).
Výzkumný plán zahrnuje též výzkum na velmi specifickém typu buněk a vývojové situaci vznikajícího protofloému v kořenech Arabidopsis thaliana. Tato část projektu bude prováděna jako spolupráce s laboratoří hormonálních regulací u rostlin Ústavu experimentální botaniky AV ČR, kde projekt v současné době běží. Během vývoje protofloému v přesně definované oblasti kořenové špičky dochází k prozatím neobjasněné dynamické přestavbě aktinového cytoskeletu. Vývoj této oblasti je postižen u rostlin postrádajících funkční Arp2/3 komplex. Vzhledem k tomu, že vývoj protofloému je spojen s budováním specifické buněčné stěny budoucích protofloémových buněk, je i tento projekt zaměřen na roli Arp2/3 a aktinu v budování buněčné stěny. Pomocí dvoufotonového konfokálního mikroskopu (buňky našeho zájmu se nacházejí uvnitř pletiva) bude studentka studovat prostorovou a časovou dynamiku exprese a lokalizace komplexu Arp2/3 v prekurzorech buněk protofloému, které bude porovnávat s prostorovou a časovou přestavbou aktinového cytoskeletu.