Fusion constructs of galectins with biomedical potential and their ligands

• Název práce v češtině: Fúzní konstrukty lidských galektinů s biomedicínským potenciálem a jejich ligandy
• Název v anglickém jazyce: Fusion constructs of galectins with biomedical potential and their ligands
• Klíčová slova: biotinylace; E. coli; fúzní konstrukt; galektin; heterologní exprese; mikrobiální enzyme; sacharid
• Klíčová slova anglicky: biotinylation; carbohydrate; E. coli; fusion construct; galectin; heterologous expression; microbial enzyme
• Akademický rok vypsání: 2020/2021
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
• Vedoucí / školitel: prof. RNDr. Pavla Bojarová, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 06.10.2020
• Datum zadání: 07.10.2020
• Datum odevzdání elektronické podoby: 04.07.2025
• Datum proběhlé obhajoby: 10.09.2025
• Oponenti: doc. MUDr. Lucie Bačáková, CSc.

Seznam odborné literatury

[1] Laaf D, Bojarová P,Elling L, Křen V, 2019. Galectin-carbohydrate interactions in biomedicine and biotechnology. Trends Biotechnol.,37, 402-415.
[2] Johannes L, Jacob R, Leffler H, 2018. Galectins at a glance. J. Cell Sci., 131, 208884.
[3] Dubé-Delarosbil C, St-Pierre Y, 2018. The emerging role of galectins in high-fatality cancers. Cell. Mol. Life Sci.,75, 1215-1226.
[4] Delaine T, Collins P, MacKinnon A, Sharma G, Stegmayr J, Rajput VK, Mandal S, Cumpstey I, Larumbe A, Salameh BA, Kahl-Knutsson B, van Hattum H, van Scherpenzeel M, Pieters RJ, Sethi T, Schambye H, Oredsson S, Leffler H, Blanchard H, Nilsson UJ, 2016. Galectin-3-binding glycomimetics that strongly reduce bleomycin-induced lung fibrosis and modulate intracellular glycan recognition. ChemBioChem,17, 1759-1770.
[5] Bumba L, Laaf D, Spiwok V, Elling L, Křen V, Bojarová P, 2018. Poly-N-acetyllactosamine neo-glycoproteins as nanomolar ligands of human galectin-3: binding kinetics and modeling. Int. J. Mol. Sci.,19, 372.

Předběžná náplň práce

Galektiny jsou rozšířené živočišné lektiny s evolučně konzervovanou doménou rozpoznávající sacharidy (CRD) a s vysokým stupněm sekvenční homologie. Specificky rozpoznávají glykany s terminálním β‑galaktosidem [1]. V lidském organismu se galektiny účastní základních buněčných procesů, jako např. růstu, vývoje a programované smrti buňky, mezibuněčné adheze, vnitrobuněčného transportu, buněčné migrace a signalizace [2]. V souvislosti s terapií nebo diagnostikou jsou nejvíce studovány obranné a patofyziologické mechanismy při srdečním selhání, kancerogenezi a při reakci organismu na zánětlivé a fibrotické procesy. Při kancerogenezi podporují galektiny např. metastatické procesy, adhezi, proliferaci a růst rakovinných buněk [3]. Pro studium interakcí galektinů s glykokonjugáty či glykomimetiky pro potenciální biomedicínské aplikace je zásadní heterologní exprese rozpustných, stabilních a dobře purifikovatelných galektinových konstruktů v dobrém výtěžku, případně i s možností detekce v biologických systémech. To je poměrně náročné zvláště u heterodimerních galektinů typu „tandem-repeat“, u nichž hraje zásadní roli i vhodná délka spojovacího linkeru a výběr optimálního fúzního konstruktu [4].
Cílem práce je příprava knihovny fúzních konstruktů lidských galektinů a optimalizace jejich heterologní exprese ve vhodném kmenu E. coli. Práce se bude zaměřovat zvláště na méně stabilní heterodimerní galektiny Gal-4, Gal-8 a Gal-9, kde bude analyzována jak produkce celého galektinu, tak i jeho jednotlivých podjednotek. Bude studován výběr produkčního systému a růstové podmínky v závislosti na podílu rozpustného proteinu a jeho biologické aktivitě. Zvláštní kapitolou práce bude optimalizace přípravy konstruktů nesoucích tzv. AVI-tag, peptidovou kotvu pro selektivní biotinylaci proteinu [5]. Tyto konstrukty jsou během vlastní exprese kovalentně biotinylovány koexprimovanou biotinligasou. Biotinylované konstrukty jsou využitelné pro studie interakce galektinu s rakovinnými buňkami pomocí průtokové cytometrie a/ nebo pro imobilizaci k měření povrchové plasmonové resonance. Součástí práce bude i vývoj metod pro stanovení biologických aktivit připravených konstruktů imunochemickými metodami, průtokovou cytometrií a povrchovou plasmonovou resonancí. V rámci práce budou pomocí geneticky modifikovaných mikrobiálních enzymů připraveny multivalentní sacharidové ligandy pro tyto galektiny.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Galectins are widespread animal lectins with an evolutionary conserved carbohydrate recognition domain (CRD) and a high degree of sequence homology. They specifically recognize glycans with a terminal β-galactoside [1]. In the human body, galectins are involved in basic cellular processes such as growth, development and programmed cell death, intercellular adhesion, intracellular transport, cell migration and signalling [2]. In relation to therapy or diagnosis, the most studied processes are protective and pathophysiological mechanisms of heart failure, cancerogenesis and the response to inflammatory and fibrotic processes. In cancerogenesis, galectins promote, for example, metastatic processes, adhesion, proliferation and growth of cancer cells [3]. The study of interactions of galectins with glycoconjugates or glycomimetics for potential biomedical applications requires heterologous expression of soluble, stable and easily-purifiable galectin constructs in good yield, eventually with the possibility of detection in biological systems. This is particularly challenging for tandem-repeat heterodimeric galectins, in which the appropriate linker length and selection of the optimal fusion construct play a crucial role [4].

The aim of this work is to prepare a library of fusion constructs of human galectins and to optimize their heterologous expression in a suitable E. coli strain. The work will focus especially on less stable heterodimeric galectins Gal-4, Gal-8 and Gal-9, where the production of the whole galectin and its individual subunits will be analyzed. The choice of the production system and growth conditions will be studied depending on the proportion of soluble protein and its biological activity. A special chapter of the work will be the optimization of the preparation of constructs carrying the so-called AVI-tag, a peptide anchor for the selective biotinylation of proteins [5]. During their expression, these constructs are covalently biotinylated by co-expressed biotin ligase. Biotinylated constructs are useful for studying the interaction of galectin with cancer cells by flow cytometry and/ or for immobilization to measure surface plasmon resonance. The work will also include the development of methods for determining the biological activities of prepared constructs by immunochemical methods, flow cytometry and surface plasmon resonance. In the frame of the work, multivalent carbohydrate ligands for these galectins will be prepared using genetically modified microbial enzymes.