Charakterizace perinukleárních aktinových vláken a jejich funkce v buněčné migraci

• Název práce v češtině: Charakterizace perinukleárních aktinových vláken a jejich funkce v buněčné migraci
• Název v anglickém jazyce: Characterization of perinuclear actin fibers and their role in cell migration
• Klíčová slova: aktin, stresová vlákna, polarizace, fokální adheze, LINC, migrace, invazivita, metastázy
• Klíčová slova anglicky: actin, stress fibers, polarization, focal adhesions, LINC, migration, invasion, metastasis
• Akademický rok vypsání: 2020/2021
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
• Vedoucí / školitel: Ing. Tomáš Vomastek, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 13.10.2020
• Datum zadání: 13.10.2020
• Datum potvrzení stud. oddělením: 13.10.2020
• Datum odevzdání elektronické podoby: 10.08.2022
• Datum proběhlé obhajoby: 12.09.2022
• Oponenti: doc. RNDr. Pavla Binarová, CSc.

Předběžná náplň práce

Buněčná migrace a invazivita hraje zásadní úlohu v mnoha fyziologických i patologických dějech, jako je např. hojení ran, embryonální vývoj, imunitní odpověď či rozsev nádorových buněk z primárního nádoru a následná tvorba metastáz. Fyziologické i patologické formy buněčné migrace jsou závislé na aktinovém cytoskeletu, který generuje síly nutné pro buněčnou translokaci jak v planárním (2D) tak i v komplexním (3D) prostředí tkání. Téma práce se zaměřuje na objasnění funkce specifické části aktinového cytoskeletu, tzv. perinukleárních stresových vláken. Tato vlákna jsou na obou koncích mechanicky spojena s fokálními adhezemi na bazální straně buňky, zatímco jejich centrální část asociuje s LINC komplexem na apikální straně jádra. V planárním 2D prostředí dává tento vícenásobný způsob mechanického zakotvení perinukleárním vláknům kupolovitou strukturu, která obklopuje jádro. Ačkoli se perinukleární aktinová vlákna vyskytují v celé řadě migrujících buněčných typů, jejich dynamika a funkce v migraci buněk zůstává z velké části neznámá.
Předpokládáme, že tato vlákna generují síly, které regulují pohyb jádra a tím usnadňují translokaci jádra během buněčné migrace. Cílem práce je objasnit mechanizmy, které se podílí na tvorbě perinukleárních aktinových vláken a popsat, jak tato vlákna optimalizují buněčnou migraci. Dále se bude sledovat, zdali se perinukleární vlákna podílejí na invazivitě nádorových buněk a tvorbě metastáz.
Práce bude zahrnovat především kultivaci živočišných buněk, inaktivaci genů pomocí CRISPR/Cas9 a RNA interference, mikroskopii v reálném čase a fluorescenční mikroskopii. Používat se budou také standardní techniky molekulární biologie, jako je klonování DNA, exprese proteinů a jejich analýza pomocí polyakrylamidové elektroforézy a imunodetekce.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Cell migration and invasion play an essential role in many physiological and pathological processes, such as wound healing, embryonic development, immune response, and tumor cell spread from the primary tumor and subsequent formation of metastasis. Physiological and pathological forms of cell migration are governed by actin cytoskeleton that generates the forces necessary for cell movement in both planar (2D) and tissue (3D) environments. The topic of the thesis is focused on the function of perinuclear actin stress fibers. These fibers are mechanically coupled at both ends to focal adhesions on the basal side of the cell while their central part associates with LINC complex on the apical side of the nucleus. In a planar 2D environment, these multiple anchoring points give perinuclear fibers a dome-like structure that surrounds the nucleus. Although perinuclear actin fibers occur in a variety of migrating cell types, their dynamics and function in cell migration remain largely unknown.
We assume that these fibers mechanically link focal adhesions with the nuclear envelope and generate forces that regulate nuclear movement and thus facilitate translocation of the nucleus during cell migration. The aim of this work is to elucidate the mechanisms involved in the formation of perinuclear actin fibers, and how these fibers optimize cell migration. It will be further investigated whether perinuclear fibers contribute to tumor cell invasiveness and metastasis.
The methodology will include the work with mammalian cell culture, gene editing using CRISPR/Cas9 system, RNA interference, and life-cell and fluorescence microscopy including superresolution microscopy. Standard molecular biology techniques such as DNA cloning, protein expression, SDS-PAGE and western blotting will be also utilized.