Practical aspects of single-cell RT-qPCR analysis

• Název práce v češtině: Praktické aspekty analýzy jednotlivých buněk pomocí RT-qPCR
• Název v anglickém jazyce: Practical aspects of single-cell RT-qPCR analysis
• Klíčová slova: jednotlivé bunky, reverzná transkripcia, preamplifikácia, kvantitatívna PCR, amyotrofická laterálna skleróza, astrocyty
• Klíčová slova anglicky: single cell, reverse transcription, preamplification, quantitative PCR, amyotrophic lateral sclerosis, astrocytes
• Akademický rok vypsání: 2018/2019
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
• Vedoucí / školitel: Ing. Lukáš Valihrach, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 09.11.2018
• Datum zadání: 09.11.2018
• Datum odevzdání elektronické podoby: 30.05.2020
• Datum proběhlé obhajoby: 13.07.2020
• Oponenti: RNDr. Gabriela Pavlínková, Ph.D.

Předběžná náplň práce

Analýza jednotlivých buněk je atraktivním a náročným oborem moderní molekulární biologie a medicíny, jejíž hlavním cílem je studium biologických otázek s jednobuněčným rozlišením. Tento přístup pomáhá charakterizovat heterogenitu buněk a popsat komplexní odezvu organismu na různé fyziologické a patofyziologické podněty. Jednou z nejlépe zavedených metod pro analýzu jednotlivých buněk je technika reverzní transkripce kvantitativní PCR (RT-qPCR), která může být využita na detekci molekul DNA, RNA či proteinů. Ačkoliv má tato technika potenciál, aby se stala rutinní metodikou, jejímu širšímu využití brání jak její komplexnost, tak i často velmi nízká koncetrace cílových molekul. Cílem této diplomové práce je zavést a experimentálně validovat efektivní protokol pro analýzu jednotlivých buněk pomocí techniky RT-qPCR zahrnující laboratorní část a analýzu dat. Hlavním těžištěm práce bude optimalizace následujících kroků: sběr jednotlivých buněk a izolace RNA, reverzní transkripce, preamplifikace, návrh qPCR esejí a zpracování dat. Faktory ovlivňující účinnost každého kroku budou pečlivě monitorovány a posouzen jejich vliv na výsledek daného experimentu. Optimalizovaný protokol analýzy jednotlivých buněk bude testován na modelových experimentech a následně implementován ve výzkumných projektech, což bude mít za následek zvýšení reprodukovatelnosti a efektivity těchto studií.

Doporučená literatura:
1) Technical aspects and recommendations for single-cell qPCR. Ståhlberg A, Kubista M. Mol Aspects Med. 2018 Feb;59:28-35. doi: 10.1016/j.mam.2017.07.004.
2) The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Ståhlberg A, Kubista M. Expert Rev Mol Diagn. 2014 Apr;14(3):323-31. doi: 10.1586/14737159.2014.901154.
3) RT-qPCR work-flow for single-cell data analysis. Ståhlberg A, Rusnakova V, Forootan A, Anderova M, Kubista M. Methods. 2013 Jan;59(1):80-8. doi: 10.1016/j.ymeth.2012.09.007.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Single-cell analysis has become an attractive and challenging field of modern molecular biology and medicine, the main goal of which is to study biological questions with single-cell resolution. Such approach reflects cell heterogeneity and reveals the complex response of an organism to various physiological and pathophysiological stimuli. Reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is one of the most developed methods for single-cell profiling that can be used to interrogate several analytes, including DNA, RNA and protein. Single-cell RT-qPCR has the potential to become routine methodology but the technique still proves challenging, as it involves several experimental steps and few molecules are handled. The aim of the diploma thesis is to establish and validate highly efficient workflow for single-cell RT-qPCR analysis, including both laboratory and data analysis part. The attention will be primarily focused on several steps of the workflow: single-cell collection and RNA extraction, reverse transcription, pre-amplification, qPCR assay design and data processing. The factors influencing the effectiveness of each step will be monitored and their impact on experimental outcome assessed. The improved analysis workflow will be tested using model single-cell experiments. The results of the diploma thesis will be implemented in various research projects and consequently will enhance the reproducibility and effectiveness of single cell RT-qPCR studies.

Recommended literature:
1) Technical aspects and recommendations for single-cell qPCR. Ståhlberg A, Kubista M. Mol Aspects Med. 2018 Feb;59:28-35. doi: 10.1016/j.mam.2017.07.004.
2) The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Ståhlberg A, Kubista M. Expert Rev Mol Diagn. 2014 Apr;14(3):323-31. doi: 10.1586/14737159.2014.901154.
3) RT-qPCR work-flow for single-cell data analysis. Ståhlberg A, Rusnakova V, Forootan A, Anderova M, Kubista M. Methods. 2013 Jan;59(1):80-8. doi: 10.1016/j.ymeth.2012.09.007.